HPLCMS法测定人血浆中羧甲司坦浓度

　　　　 作者：李婵，傅强，杨建婷，李锋武

【摘要】 目的 建立一种灵敏、高效、快速的高效液相色谱质谱分析方法，测定人血浆中羧甲司坦的血药浓度。方法 100mL/L高氯酸沉淀血浆蛋白，上清液反相高效液相色谱分离，电喷雾离子阱质谱法检测血浆样品中的羧甲司坦，多级反应模式选择离子法定量。结果 方法检测限为0.01μg/mL，线性范围为0.2～200.0μg/mL，回收率为89.2%～105.6%。结论 该方法精密、灵敏、准确，可用于生物样品中羧甲司坦的测定。

【关键词】 羧甲司坦;高效液相色谱离子阱质谱;血药浓度

ABSTRACT: Objective To establish a sensitive， valid and rapid high performance liquid chromatographytrap mass spectrometry (HPLCMS) method for determining carbocisteine concentration in human plasma. Methods Plasma samples were pretreated by 100mL/L perchloric acid to remove the interference protein. The supernatant was separated by reverse phase HPLC， electrospray MS was used to detect carbocisteine in plasma samples， and selective ion method of multiple reaction modes was used to determine the concentration of carbocisteine. Results The limit of detection was 0.01μg/mL and the linear range was 0.2-200.0μg/mL. The recovery rate was within the range of 89.2%-105.6%. Conclusion The proposed method could be used to determine carbocisteine in biological samples.

　　KEY WORDS: carbocisteine; high performance liquid chromatographytrap mass spectrometry; plasma drug concentration

　 美羧伪麻片是临床广泛应用的一种感冒药，主要成分为羧甲司坦、盐酸伪麻黄碱和氢溴酸右美沙芬。羧甲司坦具有祛痰作用，能使支气管的黏液分泌减少，痰黏度下降而易被咳出，用于治疗慢性支气管炎、支气管哮喘等症[1]。文献采用高效液相色谱蒸发光检测法或荧光检测法测定其制剂或血浆中羧甲司坦的浓度[24]，但方法灵敏度低，特异性不佳。王晓娟等[5]采用柱前在线衍生荧光检测法测定了人血浆中羧甲司坦的浓度，方法灵敏度高，有望广泛应用于该药的药代动力学研究，但费时费力，方法稳定性有待提高。本文采用高效液相色谱离子阱质谱法测定了口服美羧伪麻片人血浆中羧甲司坦的浓度，方法灵敏度高，特异性强，为生物样品中羧甲司坦的测定提供了方法。

　　1 仪器及试剂

　　1.1 药品与试剂 Agilent 1100系列高效液相色谱仪(包括二元梯度泵，7725i手动进样器，DAD二极管阵列检测器，Agilent 4.02工作站);Agilent 1100系列SL型电喷雾离子阱质谱;SartoriusBP221s型电子天平(万分之一，德国Sartorius公司)。

　　羧甲司坦对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号为1002469501);美羧伪麻片(汕头金石制药总厂，批号为080303);甲醇为色谱纯(美国Fisher公司);其他试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 对照品溶液的制备 精密称取羧甲司坦对照品4.0mg，用甲醇溶解至10.0mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制备成为0.4mg/mL的羧甲司坦对照品溶液。

　　2.2 空白血浆供试品溶液的制备 精密吸取混合人空白血浆0.5mL于1.5mL圆底离心管中，加入1.0mL(100mL/L)高氯酸水溶液，漩涡混合1min，6000r/min离心10min，取上清液0.5mL备用。

　　2.3 含药血浆供试品溶液的制备 6名健康男性受试者，按药品说明书空腹口服美羧伪麻片2片，于服药后0.5h收集血浆样品1.0mL，混合后，按2.2项下方法制备样品，即得含药血浆供试品溶液。

　　2.4 分析方法 色谱条件：色谱柱为Agilent TCC18(150mm×4.6mm，5μm);流动相为10.0mmol/L甲酸水溶液(pH 2.2)∶甲醇=92∶8(V∶V);柱温为25.0℃;流速为0.8mL/min(柱后3∶1分流)。

　　质谱条件电喷雾离子源正离子模式;喷雾电压3.5kV;毛细管电压-3200V，干燥气流速8.0L/min;干燥气温度350℃;雾化气压力40psi;雾化气温度325℃;质量扫描范围50～1000amu。此条件下，空白血浆、羧甲司坦标准品和含药血浆供试品溶液总离子流图见图1。

　　2.5 方法学考察

　　2.5.1 线性范围 取空白血浆1.0mL共7份，分别加入羧甲司坦对照品溶液，使血浆中羧甲司坦的浓度分别为0.20、1.0、5.0、25、50、100、200μg/mL，按2.2项下方法制备成系列对照品溶液。在拟定分析条件下，精密吸取20.0μL进样分析，测定峰面积，以浓度(x， μg/mL)对峰面积(y)做线性回归，得回归方程为y=8.14x+3.0472，r=0.9992。表明血浆中羧甲司坦在0.20～200.0μg/mL范围内线性关系良好。血浆中羧甲司坦的检出限为0.01μg/mL。

　　2.5.2 精密度 取空白血浆1.0mL，加入适量的羧甲司坦对照品溶液，按2.2项下方法制备成低、中、高3个浓度的羧甲司坦血浆样品供试品溶液，在1d内按样品测定法重复测定5次，计算日内相对标准偏差分别为2.7%、1.5%和1.2%(n=5)。将上述3个浓度的血浆样品在6d内陆续各重复测定5次，计算日间相对标准偏差分别为4.3%、3.1%和2.7%(n=5)。

　　2.5.3 稳定性 ①冻融稳定性：将低、中、高3个浓度的羧甲司坦血浆样品分别置于-70℃冷冻，24h后自然解冻，在拟定分析条件下，测定羧甲司坦的浓度变化，完全解冻后将样品重新冷冻24h。重复6次，观察冻融周期对样品稳定性的影响。结果表明，冻融周期对样品稳定性影响的相对标准偏差在2.2%～7.3%。

　　②短期稳定性：将低、中、高3个浓度的羧甲司坦血浆样品分别在室温下放置2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0h。按2.2项下方法制备样品，在拟定分析条件下，测定羧甲司坦的浓度变化，观察温度对样品稳定性的影响。结果表明，温度对样品稳定性影响的相对标准偏差在1.6%～6.1%。

　　③长期稳定性：将低、中、高3个浓度的羧甲司坦血浆样品分别贮存1、2、4、8周后解冻。按2.2项下方法制备样品，在拟定分析条件下，测定羧甲司坦的浓度变化，观察贮存时间对样品稳定性的影响。结果表明，贮存时间对样品稳定性影响的相对标准偏差在4.5%～9.9%。

　　④后期稳定性：血浆样品制备成功后，后期含量测定时，样品的放置时间会对测定结果产生影响，因此，本文对样品的后期稳定性进行了考察。具体如下：取低、中、高3个浓度的羧甲司坦血浆样品，按2.2项下方法制备样品，分别于0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、48.0h后进样20.0μL。在拟定分析条件下，测定羧甲司坦的浓度变化，观察进样时间对样品稳定性的影响。结果表明，进样时间对样品稳定性影响的相对标准偏差在2.1%～8.6%。

　　2.5.4 方法回收率 取混合人空白血浆1.0mL，加入适量的羧甲司坦对照品溶液，按2.2项下方法制备成低、中、高3个浓度的羧甲司坦血浆样品供试品溶液，在拟定分析条件下，进样20.0μL，计算方法回收率分别为89.2%、92.4%和105.6%。

　　2.6 含药血浆样品的测定 精密吸取2.3项下羧甲司坦人含药血浆样品供试品溶液20.0μL，在拟定分析条件下进样分析，计算的6名受试者含药血浆中羧甲司坦的平均浓度为2.63μg/mL。

　　3 讨 论

　　本文建立了人血浆中羧甲司坦的高效液相色谱质谱测定方法，方法灵敏度高、稳定性好，符合美国FDA生物样品测定方法的要求[6]，能为生物样品中羧甲司坦的测定提供方法。

　　高效液相色谱谱质谱法不仅能同时从保留时间、总离子流图和选择离子流图三方面对待测样品定性，而且能提供丰富的碎片信息，因此比传统紫外检测法、蒸发光检测法定性更为准确。另外，多级反应模式选择离子法能从分子离子峰和二级碎片离子峰两方面对待测样品进行定量分析，有效的排除了生物样品中其他物质对测定的干扰。

参考文献

　[1]李锐，骆海春，路雪芳. 高效液相色谱法测定羧甲司坦片的含量 [J]. 中国药师. 2006， 9(6): 505506.

　　[2]陈秀琳，郑小力. HPLCELSD法测定羧甲司坦颗粒中羧甲司坦的含量 [J]. 中国药品标准， 2006， 7(3):6264.

　　[3]邓冲，李锋武，赵新锋，等. HPLCFLD法测定人血浆中羧甲司坦的血药浓度 [J]. 中国药业， 2005， 14(10):6768.

　　[4]毕惠嫦，钟国平，汤铮，等. 高效液相色谱法测定人血浆中羧甲司坦浓度 [J]. 中国医院药学杂志， 2005， 25(9):828830.

　　[5]王晓娟，王荣，邓冲，等. 柱前衍生HPLCFLD法测定人血浆中羧甲司坦 [J]. 药物分析杂志， 2007， 28(3):372375.

　　[6]U.S. Department of health and human services， food and drug administration， center for drug evaluation and research (CD ER). Guidance for industry bioanalytical method validation [S/OL]. May: 2001. http ://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm.(