止血潜能实验在血栓前状态(PTS)高危人群中的应用

　　　　 作者：吴锋，马西，李晓会，车金

【摘要】 目的 探讨总体止血潜能(OHP)实验在血栓前状态(PTS)高危人群中的应用价值。方法 在尿激酶(UK)存在下，以低浓度组织因子(TF)激活血浆，在340nm处实时监测纤维蛋白形成与降解过程中的吸光度变化，从获得的凝血纤溶图求出OHP、总体凝血潜能(OCP)和总体纤溶潜能(OFP)。应用该法检测包括恶性肿瘤(n=52)、冠心病(n=31)、妊娠中晚期孕妇(n=27)在内的PTS高危人群，并以100名正常人作为对照;同时检测PTS高危人群的血浆纤维蛋白原(FIB)含量，探讨其与OHP的相关性。结果 恶性肿瘤、冠心病患者及中晚期妊娠妇女OCP和OHP值普遍增高(P<0.01)，而OFP降低(P<0.01)，表明此类人群明显存在PTS。恶性肿瘤、冠心病患者FIB含量增加，且与OHP的相关性良好(r=0.813、0.886，P<0.01)，而妊娠妇女OHP的增高与FIB无明显相关性(r=0.298，P>0.05)。结论 OHP检测方法能够反映机体止血平衡，可作为PTS高危人群的筛选方法。

【关键词】 总体止血潜能;血栓前状态;纤维蛋白原

　　ABSTRACT: Objective To investgate the application of overall hemostasis potential (OHP) experiment in the highrisk population of prethrombotic state (PTS). Methods The change of absorbance in fibrin formation and degradation was measured with a spectrophotometer at 340nm when the plasma clotting was triggered by the low concentration of TF in the presence of urokinase. The OHP， overall coagulation potential (OCP) and the overall fibrinolysis potential (OFP) were obtained from the coagulationfibrinolysis curve based on the computer analysis. To evaluate this OHP method， 52 cancer patients， 31 coronary artery disease patients， 27 mid/latestage pregnancy women and 100 healthy controls were detected. In addition， the plasma fibrinogen was detected and its correlation with OHP was studied. Results The level of OCP and OHP in PTS highrisk population was significantly higher in cancer， coronary heart disease patients and the mid/latestage pregnancy women than in the healthy controls (P<0.01)， but the level of OFP was significantly lower (P<0.01). In addition， fibrinogen of cancer， coronary heart disease patients was significantly increased compared to that of the healthy controls (P<0.05)， and had a good correlation with OHP (r=0.813， 0.886， P<0.01). However， the level of OHP in pregnant women was unrelated to fibrinogen concentration (r=0.298， P>0.05). Conclusion The OHP assay may indicate the hemostatic balance; therefore， it can be used for evaluation of PTS.

　　KEY WORDS: overall hemostasis potential; prothrombotic state; fibrinogen

血栓前状态(prethrombotic state， PTS)是指那些发生动脉和/或静脉血栓危险性增高的状态。PTS的成因十分复杂，涉及血管功能和凝血成分改变、抗凝血功能缺乏或凝血因子突变(导致凝血功能增强)、凝血因子水平获得性升高和/或纤溶活性减低。无论PTS的成因多么复杂，其主要变化是止血失衡，导致血栓形成倾向。虽然评价止血的实验方法众多，但在现行的实验中，没有一个单独的止血实验能够反映PTS，甚至多个指标联合应用也不足以确定诊断，造成PTS的诊断非常困难。

　　近来，我们建立了一种止血潜能(overall hemostasis potential， OHP)的实验方法，发现其能够反映机体的止血平衡。众多研究表明，冠心病、恶性肿瘤患者及正常妊娠妇女普遍存在PTS，表现为凝血功能亢进，纤维蛋白溶解功能降低。为评估这种OHP实验方法是否可以反映PTS，我们对冠心病、恶性肿瘤患者及中晚期妊娠妇女进行了检测，并与正常对照组进行比较;同时，检测纤维蛋白原(FIB)含量，探讨其与OHP的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及仪器

　　1.1.1 主要试剂 组织因子(TF)由Dade Behring公司提供;尿激酶(UK)购自辽宁天龙药业公司;因子Ⅷ缺乏血浆购自太平洋诊断试剂公司;聚乙烯二醇(PEG6000)及Tween80等化学品均属分析纯等级。

　　1.1.2 主要仪器 721型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);TBX92型恒温水浴箱(上海医疗器械六厂);LDS1A型离心机(北京医用离心机厂);计算机(Dell)。

　　1.2 研究对象 正常对照组共100例，均为健康成年人，来自健康查体及无偿献血者，男性58例，女性42例(年龄20～60岁);110例患者，其中包括冠心病31例、恶性肿瘤52例(年龄 26～64岁)、中晚期妊娠妇女27例(年龄22～35岁)，分别来自西安交通大学第一、第二附属医院，陕西省肿瘤医院，西安市中心医院。

　　1.3 标本采集与制备 空腹采集静脉血，按血液与抗凝剂(0.13mol/L拘橼酸钠)9∶1的比例制备抗凝血，以3000r/min离心血样15min，吸取血浆备用。

　　1.4 检测方法 参考吴锋等[1]建立的一种止血潜能实验方法。

　　1.4.1 总体止血能力(OHP)的测定 调节光度仪波长到340nm，设置测试时间30min，以缓冲液调节测试零点。预先在比色皿中加入待检血浆100μL和适量UK(用以激活血浆纤溶酶原)，随后加入900μL含组织因子的缓冲液(0.1mmol/L Tris、20g/L PEG6000、10g/L Tween80、5mmol/L CaCl2，pH 7.35)，立即混匀，然后置于测试孔内，按动测试键。仪器自动监测和记录纤维蛋白形成和降解过程的吸光度变化，计算反应曲线内面积(根据总吸光度计算)，求出OHP。

　　1.4.2 总体凝血能力(OCP)的测定 采用与上述OHP测试相同的反应体系、实验条件和操作方法，但反应体系不含纤溶酶原活化剂UK，监测30min内纤维蛋白形成过程的吸光度的变化，计算反应曲线以内总吸光度，求得OCP。

　　1.4.3 总体纤溶能力(OFP)的判断 按下列公式计算：OFP=[(OCP-OHP)/OCP]×100%。

　　1.5 纤维蛋白原(FIB)功能的测定 采用纤维蛋白原功能自动化监测系统测定[2]。

　　1.6 统计学处理 实验数据以±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。计量资料两组间比较，若方差齐时用t检验，若方差不齐采用t' 检验。变量间相关性分析计算Pearson相关系数。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 PTS高危人群OCP、OHP、OFP和FIB的测定结果 冠心病患者、恶性肿瘤患者、中晚期妊娠妇女与正常对照组比较，OCP和OHP值均明显增高(P<0.01)，而OFP值减低(P<0.01)，同时FIB含量增高(P<0.05，表1)。表1 PTS高危人群OCP、OHP、OFP和FIB水平的测定结果

　　2.2 FIB含量与OHP的相关性 冠心病、恶性肿瘤两组FIB含量增加，与OHP的相关性良好(r=0.886、0.813，P<0.01)，而妊娠组OHP的增高与FIB无相关性(r=0.298，P>0.05)。

　　3 讨 论

　　冠心病是以动脉硬化为基础的血栓并发症[34]。动脉硬化是基于血管内皮损伤，凝血成分及细胞成分与损伤的内皮细胞之间相互作用，形成动脉硬化斑块。动脉硬化斑块反复地自发性或机械性破裂，斑块内致栓物质暴露于血液中，循环当中的血小板与暴露的胶原及vonWillebrand因子黏附，在此被激活并聚集形成富含血小板的白色血栓。与此同时，凝血因子被暴露的TF激活，诱发凝血瀑布反应，最终在动脉硬化斑块处形成纤维蛋白，造成管壁狭窄(栓塞)，引起心肌缺血、缺氧。血管内皮细胞损伤所导致凝血成分异常激活是动脉硬化及冠心病的重要发病原因。凝血成分异常激活必然破坏止血平衡，有利于血栓形成。

　　恶性肿瘤在肿瘤免疫性淋巴细胞刺激下可以合成和分泌大量TF[57]，而TF是最重要的凝血激活物。TF一旦暴露在血液当中，即可直接激活因子Ⅶ，并与因子Ⅶ形成复合物，启动凝血瀑布。这也是为什么在恶性肿瘤患者当中有相当高的血栓并发症发生。目前，抗凝治疗已经成为预防恶性肿瘤患者血栓并发症的治则。

　　妊娠期间，孕妇体内雌激素水平逐渐升高，血浆纤维蛋原及凝血因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅻ及激肽释放原都有不同程度的增高，特别是到了妊娠晚期尤为明显;而妊娠晚期孕妇的FIB明显升高，同时胎盘组织产生大量的纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)[8]。这一系列因素使妊娠期妇女血液处于高凝、低纤溶状态，极易诱发DIC及血栓性病。

　　本实验是在凝血反应的新模式及纤维蛋白原转变的动力学原理的基础上，参考HE等[910]的方法，在纤溶酶原活化物UK存在下，以低浓度TF激活血浆，在340nm实时监测纤维蛋白形成与降解过程中的吸光度变化，直观显示和记录整个反应过程的数据，绘制反应曲线，并根据获得的凝血纤溶图，求出OCP、OHP和OFP。在此过程中，血浆由液相转变为凝胶相，又由凝胶相转变为液相，并在吸光度上产生明显变化，通过仪器自动记录吸光度的变化过程。凝血纤溶动态图可以快速且动态地了解凝血、纤溶状态，判断机体止血潜能是否平衡。

　　研究发现，冠心病、恶性肿瘤患者和妊娠妇女的OCP、OHP较正常人明显增加，而OFP明显降低，表明此类人群止血失衡，存在明显的PTS。与此同时，发现冠心病、恶性肿瘤患者和妊娠妇女的血浆FIB水平也明显升高，其中冠心病和恶性肿瘤患者的FIB水平升高与OHP值增高有明显相关性，提示FIB是导致冠心病和恶性肿瘤血栓形成倾向的一个重要因素。妊娠妇女止血平衡的改变与上述冠心病和恶性肿瘤患者类似，但FIB水平增高与OHP无相关性，这可能是由于妊娠妇女凝血因子Ⅷ活性获得性增高所致。凝血因子水平增高可能会引起凝血酶生成增多，而凝血抑制剂又不足以对凝血酶及活化的凝血因子进行灭活，导致机体处于PTS。凝血因子活性获得性增高很可能是妊娠妇女出现PTS的一个重要原因。

参考文献

　　[1]吴锋，马西，庄贵华，等. 一种总体止血能力检测方法及应用 [J]. 血栓与止血学， 2007， 13(3):121125.

　　[2]马西. 血浆纤维蛋白原功能自动检测系统 [J]. 血栓与止血杂志， 1998， 5(4):181185.

　　[3]李燕平，严祥，苏海翔，等. 冠心病凝血机制的研究 [J]. 兰州学院学报， 2000， 26(3):3536.

　　[4]邱丽君，王淑香，周琪，等. 冠心病患者止凝血与纤溶指标检测的临床意义 [J]. 上海第二医科大学学报， 2002， 22(5):445447.

　　[5]PAUL CW. The pathogenesis of venous thromboembolism in cancer: emerging links with tumour biology [J]. Hematol Oncol， 2006， 24:126133.

　　[6]徐成伟，王芳，吴文秀，等. 肿瘤患者凝血及纤溶状态的改变 [J]. 齐鲁医学检验， 2003， 14(3):1011.

　　[7]何丽容，池沛冬，雷穗妮，等. 血栓、止血试验在肿瘤疾病中的应用 [J]. 现代医学仪器与应用， 2003， 15(4):2627.

　　[8]刘泽霖，贺石林，李家增. 血栓性疾病的诊断与治疗学 [M]. 北京：人民卫生出版社， 2000:461462.

　　[9]HE S， BREMME K， BLOMBACK M. A laboratoty method for determination of overall haemostatic potential in plasma I. Method design and preliminary results [J]. Thromb Res， 1999， 96:145156.

　　[10]HE S， ANTOVIC A， BLOMBACK M. A simple and rapid laboratoty method for determination of haemostatic potential in plasma. II. Modifications for use in routine laboratory and research work [J]. Thromb Res， 2001， 103:355361