rAAV2/1Acrp30对动脉粥样硬化的GK大鼠NFκB及黏附分子的影响

　　　　 作者：钟惠菊，张颖，李强翔，李果

【摘要】 目的 观察rAAV2/1Acrp30对动脉粥样硬化GK大鼠模型血清可溶性细胞间黏附分子(sICAM1)、可溶性血管内皮黏附分子(sVCAM1)水平和NFκB表达的影响，从血管炎症的角度探讨脂联素对糖尿病大血管病变的作用。方法 将造模成功的30只动脉粥样硬化的GK大鼠分为三个处理组：①模型1组，后肢肌肉注射盐水;②模型2组，后肢肌肉注射空病毒rAAV2/1;③治疗组，后肢肌肉注射 rAAV2/1Acrp30。治疗8周后处死所有大鼠，比较三组之间血清sICAM1，sVCAM1及主动脉处NFκBp65 mRNA的表达水平。结果 治疗组和模型1组、模型2组比较，血清sVCAM1、sICAM1显著降低(P<0.05)。治疗组和模型1组、模型2组比较，主动脉NFκBp65 mRNA表达显著下调(P<0.05)。结论 rAAV2/1Acrp30可通过抑制NFκB的表达，减轻炎症反应而对糖尿病大血管病变产生保护作用。

【关键词】 脂联素;2型糖尿病大血管病变;核转录因子;可溶性细胞间黏附分子;可溶性血管内皮黏附分子

　)ABSTRACT: Objective To study the effects of rAAV2/1Acrp30 on sICAM1 and sVCAM1 level as well as NFκB expression in GK rats with diabetic arteriosclerosis so as to explore the effect of adiponectin on diabetic macroangiopathy. Methods A total number of 30 atherosclerotic GK rat models were randomly pided into three groups: ① Model group one (M1): hind limb intramuscular injection of normal saline; ② Model group two (M2): hind limb intramuscular injection of vacuity virus rAAV2/1; ③ Treatment group (T): hind limb intramuscular injection of rAAV2/1-Acrp30 at a dose of 1×1012mg/L. After 8 weeks treatment， the rats were killed， and serum sVCAM1 and sICAM1 level as well as aortic NFκBp65mRNA expression were measured in each group. Aortic NFκBp65mRNA expression was measured by RTPCR.Results Compared with those in control model groups (M1 and M2)， sVCAM1 and sICAM1 levels were decreased significantly in the treatment (T) group (P<0.05). Aortic NFκBp65 mRNA expression was significantly downregulated in the treatment (T) group compared with that in control model groups (M1 and M2) (P<0.05). Conclusion rAAV2/1Acrp30 may produce protective effects on diabetic atherosclerosis by decreasing inflammatory reactions.

　　KEY WORDS: adiponectin; diabetic macroangiopathy; nuclear factorκB (NFκB); soluble intercellular adhesion molecule (sICAM1); soluble vascular cell adhesion molecule (sVCAM1)

　炎症发病学说是近年来2型糖尿病病因与发病机制的重大进展。该学说认为：炎症反应在2型糖尿病及大血管病变的发生、发展中具有重要作用。核因子NFκB(nuclear factor)是调控基因转录的重要因子，它可与许多蛋白质基因启动子和增强子部位的κB序列结合，诱导这些蛋白表达增强，从而参与炎症反应及动脉粥样硬化等多种疾病的病理过程。NFκB的活化会极大的刺激炎症因子如血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule1， VCAM1)、细胞间黏附分子1(intracellular adhesion molecule1， ICAM1)、E选择素(Eselectin)等细胞黏附分子的转录与表达。上述细胞因子的增多可趋使单核巨噬细胞、淋巴细胞的侵入和聚集在动脉内膜下，内膜下的细胞活化后可合成及分泌前炎症介质如白介素6、白介素8、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNFα)等[1]。NFκB是动脉粥样硬化前炎症介质、炎症因子和炎症产物的中枢调节者[2]。

　　脂联素(adiponectin， APN， Acrp30)是由脂肪细胞分泌的一种蛋白质。研究证实脂联素与胰岛素抵抗密切相关，具有抗动脉粥样硬化形成、抗炎症和损伤后抗内膜增生的特性。因此，脂联素与糖尿病心血管疾病密切相关，脂联素水平的下降是糖尿病及其心血管并发症的一个重要的独立危险因素[34]，补充脂联素可能是对上述疾病的一种新的治疗手段。转基因技术是补充脂联素的一种方法。在本课题前期研究中，我们课题组已成功构建rAAV2/1Acrp30载体[4]和糖尿病动脉粥样硬化模型[5]。在本次研究中，我们将探讨rAAV2/1Acrp30对2型糖尿病动脉硬化模型大鼠黏附分子及NFκB的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 6月龄雄性SPF级自发性糖尿病GK大鼠90只[购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格号：SCXK(沪)20060003]。适应性饲养1周后，选取随机血糖值(罗氏全血葡萄糖测试仪)在11.1mmol/L以上的GK大鼠88只纳入本实验。按1只/笼饲养于独立通气笼具(IVC)系统内。温度(22±1)℃，湿度59%～61%，每天光照与黑暗时间各12h。所用笼具、饲料、垫料、饮水均高压灭菌(15磅，20min)。实验期间的灌胃、换水、添加饲料等操作均在超净工作台内进行，由专人管理。

　　1.2 试剂和仪器 Rneasy Mini Kit：QIAGEN;ReverTra AceαTM，First Strand cDNA Synthesis Kit：TOYOBO;Taq DNA聚合酶：美国Fermentas公司;dNTPs：美国Fermentas公司，DNA Marker DL 2000：TaKaRa;大鼠ICAM1 ELISA试剂盒：美国ADL公司;琼脂糖：西班牙进口分装;rAAV2/1Acrp30：本课题组合成;空载腺相关病毒：本元正阳生物公司;H7500透射电子显微镜：日本日立电子公司;AL104电子天平：MettlerToledo公司;超净台：BOXUN公司;PCR仪：Biometra;UNOⅡ水平电泳槽：北京君意东方仪器公司，JYSPC;电泳仪：北京鼎国生物技术发展中心，DGⅢ双稳数显电泳仪;凝胶成像系统：柯达紫外显相系统400W像素;酶标分光仪：Quant Instuments inc公司。

　　1.3 动物建模 大鼠适应性饲养1周后，随机选取血糖值(怡成全血葡萄糖测试仪)在11.1mmol/L以上的GK大鼠，同时喂饲高脂饲料(普通饲料87.5%、精炼猪油10%、胆固醇2.0%、猪胆盐0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%)。模型组在喂饲高脂饲料的基础上加用10mg/(kg·d)一氧化氮合成酶(nitric oxide svnthase， NOS)抑制剂—N硝基L精氨酸甲酯(LNAME)灌胃。同时，Wistar组喂饲普通饲料，生理盐水灌胃，连续8周[5]。

　　1.4 实验动物分组及处理 除去造模失败及死亡大鼠，将30只动脉硬化GK鼠纳入本实验。随机数字法分为以下三个处理组：①模型1组(model group one， M1)：后肢肌肉注射生理盐水;②模型2组(model group two， M2)：后肢肌肉注射空病毒rAAV2/1;③治疗组(treatment group， T)：后肢肌肉注射rAAV2/1Acrp30：1×1012mg/L。

　　1.5 标本采集 光镜和扫描电镜样本制备及观察。

　　治疗阶段：实验第0，8周，各组大鼠在禁食的基础上，眶静脉采血一次约2mL，低速离心机3300r/min离心后分离出血清。实验第8周，在禁食的基础上处死所有大鼠，用100mL/L的水合氯醛按3mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。迅速打开胸腔，腹主动脉采血。低速离心机3300r/min离心后分离出血清，用于测定血脂及sICAM1。将灌流针从心尖部位插入左心室至主动脉，快速灌注100mL生理盐水，再用500mL生理盐水经心脏反复灌洗至发白，灌毕约30min，取主动脉弓下段2～3cm主动脉，用预冷的生理盐水清洗，去除周围结缔组织，于-70℃冰箱保存。

　　1.6 指标测定 ELISA法测血清sICAM1，sVCAM1。试剂盒购自美国ADL公司。RTPCR测主动脉NFκBp65 mRNA。

　　1.7 统计学方法 各实验独立重复3次以上，重复性好。利用SPSS11.0软件进行统计分析。计量数值皆以±s表示。多样本均数间采用单因数方差分析(oneway ANOVA)，方差不齐的采用TamhanecsT2统计方法检验，P<0.05表示差异有显著性意义。

　　2 结 果

　　rAAV2/1Acrp30对模型大鼠血清sICAM1、sVCAM1、主动脉NFκBp65 mRNA水平的影响显示：治疗8周后，T组sICAM1，sVCAM1水平较M1组及M2组明显下降(P<0.05，见表1、表2)，T组治疗前(0周)与治疗后(8周)相比，sICAM1、sVCAM1水平明显下降(P<0.05，表1、表2)。治疗组T主动脉处NFκBp65 mRNA表达水平较M1组及M2组低(P<0.05，表3、图1)。表1 各组大鼠血清可溶性细胞间黏附分子变化表2 各组大鼠血清可溶性血管细胞间黏附分子的变化表3 各组大鼠主动脉NFκBp65 mRNA表达水平的半定量比较

　　3 讨 论

　　脂联素是由脂肪细胞分泌的一种蛋白质。研究证实脂联素与胰岛素抵抗密切相关，具有抗动脉粥样硬化形成、抗炎症和损伤后抗内膜增生的特性。已有大量研究把脂联素作为抗动脉粥样硬化及抗炎的治疗手段，将表达人脂联素的腺病毒转染给载脂蛋白E缺乏小鼠，14d后动脉窦处的动脉粥样斑块与对照组比较减小约30%，免疫组织化学显示腺病毒携带的脂联素转移入粥样硬化斑块脂纹的泡沫细胞内[67]。

　　A， M: marker; 1: system materials for internal reference (GAPDH); 2: model group one (M1); 3: model group two (M2); 4: treatment group (T)脂联素基因敲除的大鼠出现血管炎症反应，导致血管机械性损伤，新生血管壁增厚，血管平滑肌增生。此时如果补充脂联素，那么这些情况就会改善[6]。脂联素可以抑制血管内皮细胞炎症及黏附，抑制泡沫细胞的形成，抑制血管平滑肌的增殖，抑制炎性因子的产生等，在动脉粥样硬化形成的各个阶段发挥其保护作用。

　　在目前国内外的研究中[89]，主要通过两条途径来提高局部或血脂联素水平。第一是注射外源性脂联素。为达到稳定的血浓度，需要注射泵持续的注入，无论从经济性和便利性，该方法都不适用于今后临床应用。第二是转基因治疗。以腺病毒或腺相关病毒(adeno associated virus， AAV)为载体。腺相关病毒载体因具有转染效率高、表达稳定、表达持续时间长，致病性、免疫原性低和基因定点整合等优点而倍受瞩目[8]。因此，本实验采用腺相关病毒为载体。

　　本实验通过注射rAAV2/1Acrp30后，主动脉处炎症因子的中枢调节者NFκB的表达下降，炎症因子ICAM1、VCAM1的水平下降。已有研究表明脂联素可以抑制血管内皮细胞炎症及单核细胞对内皮的黏附，具有抗内皮细胞炎症反应的作用。脂联素的缺乏导致了血管内皮功能紊乱及其白细胞对内皮黏附增加的炎症状态。在动脉粥样硬化的早期，内皮细胞可被炎症因子包括肿瘤坏死因子(TNFα)激活，激活的TNFα能使人类主动脉内皮细胞(HAECs)表面的黏附分子如：VCAM1、E选择素、ICAM1表达增多，从而促进人类单核细胞系THP1粘附到HAECs。但是，TNFα的这个作用能被脂联素呈剂量依赖性抑制，进一步研究发现脂联素与HAECs 呈特异性结合，而不影响HAEC上TNFα受体的数量，脂联素呈剂量依赖性增加HAEC中cAMP的聚集，从而抑制TNFα介导的NFκB的抑制分子(IκBα)的快速磷酸化与降解及接下来的NFκB的活化。因此，可知脂联素可能通过cAMP蛋白激酶通道抑制内皮细胞的NFκB信号传递通路，抑制内皮细胞粘附分子的表达和单核细胞与内皮细胞的粘附，从而调控内皮细胞的炎症反应[1012]，而发挥作用的具体机制和信号通路还有待进一步的研究。

参考文献

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