苦参碱抑制人雄激素非依赖性PC3细胞增殖和诱导凋亡的研究

　　　　 作者：张鹏，王子明，纪宗正，种铁，黄辰，高彩霞

【摘要】 目的 研究苦参碱对人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法 不同浓度苦参碱作用PC3细胞后，应用MTT法观察苦参碱对PC3细胞增殖的影响，流式细胞仪研究苦参碱对PC3细胞周期的影响，TUNEL法、Annexin V/PI双染分析苦参碱对PC3细胞凋亡的影响。结果 苦参碱对PC3细胞的生长具有抑制作用，与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。苦参碱对PC3细胞的增殖抑制作用呈现时间及剂量依赖性关系。苦参碱的最佳药物浓度为1.0g/L，最佳作用时间为48h。流式细胞仪分析显示不同浓度苦参碱均可使PC3细胞阻滞于G0/G1期，随着苦参碱浓度的增加，G0/G1期细胞所占的比例增加，与对照组相比有统计学差异(P<0.01)。TUNEL法、Annexin V/PI分析显示不同浓度苦参碱均可诱导PC3细胞凋亡，其早期凋亡率及晚期凋亡率随着苦参碱浓度的增加而升高，呈现剂量依赖性关系(P<0.05，P<0.01)。结论 苦参碱在体外可抑制PC3细胞的增殖，具有时间和浓度依赖关系。抑制增殖和细胞周期阻滞与G0/G1期相关。苦参碱可诱导PC3细胞凋亡，与苦参碱的作用浓度及时间有关。

【关键词】 前列腺癌;苦参碱;细胞凋亡

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effects of matrine on the proliferation， cell cycle， apoptosis of androgen independent prostate cancer (AIPC) cell line PC3 in vitro. Methods PC3 cells were treated by different concentrations of matrine. The inhibitory effect of matrine on the proliferation of PC3 cells was observed by MTT method. The cell cycle of PC3 cells treated by matrine was observed by flow cytometric assay. Apoptosis of PC3 cells induced by matrine was determined with TUNEL and Annexin V/PI staining assay. Results MTT test showed that PC3 cells treated by matrine had an inhibitory effect， which was significantly different from that of controls (P<0.05). Matrine markedly inhibited cell proliferation of PC3 in dose and timedependent manners. The optimal dose of matrine which inhibited PC3 cells was 1.0g/L and the best time of inhibition was at 48h. Flow cytometric assay showed that the PC3 cells treated by different doses of matrine were arrested in cell cycle progression at G0/G1 phase. The cell ratio at G0/G1 phase increased with the increase of matrine dose， which was significantly different from that of controls (P<0.01). TUNEL and Annexin V/PI staining assay showed that matrine could obviously induce the apoptosis of PC3 cells. The ratio of early and late apoptosis of PC3 cells treatedby matrine was increased in a dosedependent manner (P<0.05， P<0.01). Conclusion Matrine could inhibit the proliferation of PC3 cells in dose and timedependent manners in vitro. The inhibition mechanism was associated with arresting cell cycle at G0/G1 phase. Matrine could induce the apoptosis of PC3 cells， which might be associated with the dose and action time of matrine.

　　KEY WORDS: prostate cancer; matrine; apoptosis 雄激素非依赖性前列腺癌(androgen independent prostate cancer， AIPC)是前列腺癌进展的致命形式。目前对AIPC的治疗主要采用化疗，患者生存期一般不超过1年。苦参碱(matrine， MA)是中药苦参的主要有效成分[1]。研究表明苦参碱对肺癌、卵巢癌等的细胞生长具有抑制作用[23]，这种作用与其诱导肿瘤细胞凋亡有关。本实验通过不同浓度的苦参碱作用于AIPC细胞株PC3，研究苦参碱对PC3细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株 人AIPC细胞株PC3由西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室提供。该细胞系来源于一位62岁白人男性前列腺癌患者的骨转移灶，其酸性磷酸酶和5α还原酶活性低，不产生前列腺特异性抗原(prostate specific antigen， PSA)，不表达雄激素受体。

　　1.1.2 主要试剂 苦参碱由西安鸿生生物科技有限公司惠赠，纯度>980g/L。胎牛血清、RPMI1640培养液、四甲基偶氮唑蓝溶液(MTT)、碘化吡啶(PI)均购自美国GIBCO公司。二甲亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司。TUNEL检测试剂盒、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司。Annexin V/FITC apoptosis detection kit Ⅰ购自美国BD公司。

　　1.1.3 主要仪器 高通量多功能微板测试系统购自德国BMG LABTECHNOLOGIES公司。FASCalibur型流式细胞仪购自美国FALS CALIBAR BD公司。TCS SP2型激光扫描共聚焦显微镜购自德国LEICA公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 在37℃、50mL/L CO2环境下，将PC3细胞培养于含100mL/L灭活FBS的RPMI1640培养液中。取对数生长期细胞，2.5g/L的胰酶消化成单细胞悬液进行实验。

　　1.2.2 MTT法检测苦参碱对PC3细胞增殖活性的影响 将单细胞悬液以每孔5×104个细胞的密度接种于96孔培养板，每孔0.1mL，培养24h，使细胞贴壁，加入苦参碱，使其终质量浓度分别达到0.5、1.0、1.5、2.0g/L，另设调零孔和阴性对照孔，每组设5个复孔，培养12、24、48、72h后每孔分别加入5g/L MTT溶液20μL，孵育4h，吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡15min，在高通量多功能微板测试系统490nm波长处测得各孔吸光度(A)值，此实验重复3次，取其均值。计算细胞增殖抑制率(%)=[1-(A苦参碱组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)]×100%。

　　1.2.3 细胞周期测定 将单细胞悬液以每孔5×105个细胞的密度接种于6孔培养板，每孔1mL，孵育4h，加入苦参碱，使其终浓度分别达到0.5、1.0、1.5、2.0g/L，另设阴性对照孔，每组设2个复孔，培养24h，收集悬浮及贴壁细胞，750mL/L乙醇固定，-20℃保存。检测时，离心弃乙醇，洗涤后加入PI染色缓冲液(50g/L PI和15g/L RNase)，避光染色20min，流式细胞仪检测DNA含量，进行细胞周期分析及凋亡检测，用FACSort Cell Quest软件(美国BD公司)做DNA分析。

　　1.2.4 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL) 将单细胞悬液以每孔5×105个细胞的密度接种于24孔培养板，每孔中预先放入1枚25mm2盖玻片，孵育4h，加入苦参碱，使其终浓度分别达到0.5、1.0、1.5、2.0g/L，另设阴性对照孔，每组设3个复孔，培养24h，洗涤细胞爬片，40g/L多聚甲醛室温固定30min，30mL/L h3O2处理10min，Triton X100处理30min，洗涤后每张爬片加20μL含TdT和DIGdUTP标记缓冲液，孵育2h，洗涤后每张爬片加封闭液50μL，孵育30min，弃封闭液。加生物素化抗地高辛抗体，孵育30min，洗涤，加SABC孵育30min。DAB显色，脱水、透明、封片。细胞核被染为棕黄色者为阳性细胞。每张爬片随机取5个高倍视野(×400)，并进行阳性细胞计数。

　　1.2.5 Annexin V/PI双染色分析 将单细胞悬液以每孔5×105个细胞的密度接种于24孔培养板，孵育4h，加入苦参碱，使其终浓度分别达到0.5、1.0、1.5、2.0g/L，另设阴性对照孔，每组设2个复孔，培养24h，Binding buffer洗涤细胞，加入1mL Binding buffer、5μL Annexin VFITC和5μL PI溶液。孵育15min，流式细胞仪检测分析，用FACSort Cell Quest软件做DNA分析，488nm 氩离子激光器激发，激光共聚焦显微镜取图。

　　1.3 统计学分析 所获资料用SPSS10.0统计学软件进行方差分析，结果以±s表示，当P<0.05时为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 苦参碱对PC3细胞增殖的影响 苦参碱作用PC3细胞12～72h后，MTT法观察细胞吸光度(A值)变化，通过公式计算出细胞生长抑制率(表1)。苦参碱对PC3细胞的生长具有明显的抑制作用，随着苦参碱浓度的增加、作用时间的延长，其增殖抑制作用增强。0.5、1.0、1.5、2.0g/L浓度苦参碱组的生长抑制率与对照组相比均有统计学差异(F=8.372，P<0.05);同一浓度苦参碱在作用12、24、48、72h时的生长抑制率与对照组相比亦均有统计学差异(F=13.220，P<0.05)，苦参碱对PC3细胞的增殖抑制作用呈现时间及剂量依赖性关系。苦参碱作用PC3细胞后其生长抑制率有统计学差异的最低浓度为1.0g/L，此为苦参碱作用的最佳药物浓度。在作用48h时苦参碱对PC3细胞的增殖抑制作用最强，在72h后抑制作用开始减弱，苦参碱最佳作用时间为48h。表1 苦参碱对PC3细胞生长抑制率的影响

　　2.2 苦参碱对PC3细胞周期的影响 苦参碱作用PC3细胞24h后，流式细胞仪分析细胞周期变化(表2)。不同浓度苦参碱均可导致PC3细胞被阻滞于G0/G1期，随着苦参碱浓度的增加，G0/G1期细胞所占的比例总体呈现增加趋势，与对照组相比有统计学差异(F=32.659， P<0.01)，同时伴随着S期和G2/M期细胞比例的下降。细胞凋亡分析在图1中均可检测到细胞凋亡峰，其为位于G0/G1峰前面的亚二倍体峰，随着苦参碱浓度的增加，细胞凋亡率(表2、图1)总体呈现上升趋势，与对照组相比有统计学差异(F=89.202，P<0.01)。

　　2.3 TUNEL检测结果 苦参碱作用PC3细胞24h后，TUNEL法检测细胞凋亡情况(表3、图2)。不同浓度苦参碱均可使PC3细胞发生细胞凋亡，随着苦参碱浓度的增加，细胞凋亡数增加，呈现剂量依赖性关系，与对照组相比均有统计学差异(F=12.751，P<0.01)。表2 苦参碱对PC3细胞周期分布及细胞凋亡率的影响表3 苦参碱对PC3细胞凋亡的影响

　　2.4 苦参碱作用PC3细胞的Annexin V/PI双染色分析 苦参碱作用PC3细胞24h后，Annexin V/PI双染色分析细胞凋亡情况(表4、图3)。不同浓度苦参碱均可使PC3细胞发生细胞凋亡，PC3细胞的早期凋亡率及晚期凋亡率随着苦参碱浓度的增加而升高，呈现剂量依赖性关系，与对照组相比均有统计学差异(F=4.771， P<0.05;F=18.642， P<0.01)。同一浓度苦参碱引起PC3细胞早期凋亡率与晚期凋亡率之间无统计学差异(P>0.05)。苦参碱作用后，PC3细胞出现了不同程度的坏死，随着苦参碱浓度的增加，坏死细胞比例增加，与对照组相比有统计学差异(F=11.410， P<0.01)。表4 苦参碱对PC3细胞凋亡的影响

　　3 讨 论

　　细胞过度增殖是恶性肿瘤的生物学特性之一，对癌细胞生长抑制的程度可反映肿瘤的治疗效果。为了研究苦参碱对PC3细胞是否具有增殖抑制作用，我们采用MTT法观察了不同浓度苦参碱对PC3细胞体外增殖作用的影响。结果显示，不同浓度苦参碱均可使PC3细胞数量减少、细胞增殖受到抑制，这种抑制作用随着苦参碱浓度的增加而增强，与对照组相比均有统计学差异(P<0.05);同一浓度苦参碱作用不同时间的生长抑制率亦随着时间的延长而增高，与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)，苦参碱对PC3细胞的增殖抑制作用呈现时间及剂量依赖性关系。这与部分学者关于肝癌、胃癌等的研究结果相一致[45]。实验显示苦参碱在体外对PC3细胞有较强的细胞毒性作用。选择PC3细胞增殖受到明显抑制的最低浓度1.0g/L作为苦参碱的最佳药物浓度;选择PC3细胞增殖抑制作用最强的时间48h作为苦参碱的最佳作用时间。

　　细胞周期与细胞的增殖密切相关。细胞周期的长短主要取决于G0/G1期，G0/G1期阻滞可使细胞增殖周期延长，增殖速度减慢。细胞周期阻滞，是细胞对各种损伤因素的正常反应，可使细胞在进入S期或M期前有足够的时间修复受损的DNA，如果DNA损伤不能修复，则诱导细胞凋亡。本研究发现，不同浓度苦参碱作用24h后均可使PC3细胞被阻滞于G0/G1期。随着苦参碱浓度的增加，G0/G1期细胞所占的比例总体呈现增加趋势，与对照组相比有统计学差异(P<0.01)，同时伴随着S期和G2/M期细胞比例的下降。细胞凋亡率亦随着苦参碱浓度的增加而上升，与对照组相比有统计学差异(P<0.01)。这与细胞增殖抑制实验的结果相一致，表明苦参碱使细胞无法从G1期进入S期，堆积在G0/G1期，出现G2/M阻滞，阻止细胞进行有丝分裂，从而抑制细胞的增殖。

　　凋亡是中药抑制肿瘤细胞增殖的一条很重要的途径。本实验采用TUNEL法及AnnexinV/PI双染色法进行PC3细胞凋亡的检测，TUNEL法研究显示，不同浓度苦参碱均可使PC3细胞发生细胞凋亡，凋亡细胞数与苦参碱浓度之间呈现剂量依赖性关系，与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。AnnexinV/PI双染色法研究显示PC3细胞的早期凋亡率及晚期凋亡率随着苦参碱浓度的增加而升高，与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。这说明苦参碱对PC3细胞凋亡的影响有剂量依赖性，既可增加细胞的早期凋亡率，也可增加细胞的晚期凋亡率，苦参碱具有诱导加速PC3细胞凋亡的作用。进一步研究发现，随着苦参碱药物浓度的增加和作用时间的延长，PC3细胞的坏死比例显著增高。这可能是因为不同的药物浓度和作用时间对细胞产生的抑制效应不同，大剂量或长的作用时间也易导致细胞坏死而非凋亡，相对较小剂量和短时间作用更易引起细胞自身内部的改变。

　　以上研究表明，苦参碱在体外能显著抑制人AIPC细胞系PC3细胞株增殖并诱导细胞凋亡。

参考文献

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　　[2]钟梁，刘北忠，郝坡，等. 苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对人端粒酶逆转录酶表达的影响 [J]. 中草药， 2008， 39(10):15071510.

　　[3]申志华，揭伟，陈锦，等. 苦参碱对人卵巢癌细胞株HO8910PM增殖及侵袭运动能力的影响 [J]. 中草药， 2008， 39(3):386390.

　　[4]郑艳敏，李轩，赵红艳，等. 苦参碱和氧化苦参碱对SMMC7721细胞增殖及Stat3， Stat5基因表达的影响 [J]. 中国中药杂志， 2008， 33(19):22342237.

　　[5]于晓峰，邹健，冉志华. 氧化苦参碱对人胃癌细胞杀伤作用的机制 [J]. 世界华人消化杂志， 2007， 15(15):17191724