乳腺癌VEGFC和VEGFR3表达与淋巴结转移关系的研究

　　 ：作者：王虎霞，盛薇，王光辉，樊林，单涛，赵伟，李萌

【摘要】 　　目的 探讨乳腺癌血管内皮生长因子C(VEGFC)、血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)的表达及其与淋巴结转移的关系。方法 用免疫组化SP法检测60例乳腺浸润性导管癌VEGFC、VEGFR3的表达，并取15例乳腺纤维腺瘤标本作对照。结果 乳腺癌组VEGFC、VEGFR3阳性表达率及表达程度均明显高于对照组，差异有统计学意义(P均<0.05)。乳腺癌淋巴结转移阳性组VEGFC、VEGFR3表达率及表达程度高于淋巴结转移阴性组(P均<0.05)，VEGFC、VEGFR3的表达与乳腺癌腋淋巴结转移呈正相关(P均<0.05)。乳腺癌VEGFC与VEGFR3的表达呈正相关(P<0.05)。按肿块大小等临床病理指标的分组中，VEGFC、VEGFR3表达无显著性差异(P均>0.05)。结论 乳腺癌组织中VEGFC、VEGFR3表达水平增高，VEGFC、VEGFR3表达促进乳腺癌淋巴结的转移。

【关键词】 乳腺癌 血管内皮生长因子C 血管内皮生长因子受体3 淋巴结转移

　　ABSTRACT: Objective To study the expressions of vascular endothelial growth factor C (VEGFC) and vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGFR3) in breast cancer and their correlations with lymph node metastasis. Methods Immunohistochemical SP method was adopted in detecting VEGFC and VEGFR3 protein expressions in 60 cases of breast cancer and 15 cases of breast fibroadenoma as controls. Results The positive rate and degree of VEGFC and VEGFR3 expressions in breast cancer were significantly higher than those in the control group (P<0.05). VEGFC and VEGFR3 were conspicuously higher in lymphnodepositive group than in lymphnodenegative group (P<0.05). The expressions of VEGFC and VEGFR3 were positively correlated with axillary lymph node metastasis; VEGFC expression was positively associated with VEGFR3. However， there were no significant differences in pathologic features， tumor size and clinical stage. Conclusion The expressions of VEGFC and VEGFR3 were higher in breast cancer， and they promoted lymph node metastasis.

　　KEY WORDS: breast cancer; vascular endothelial growth factor C (VEGFC); vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGFR3); lymph node metastasis

　　乳腺癌淋巴结转移的研究一直是人们关注的热点。血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C， VEGFC)是研究较多的特异性促淋巴管生成因子，在多种肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移中发挥重要作用，但其促淋巴结转移的具体机制尚不清楚。关于血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor 3， VEGFR3)在肿瘤淋巴结转移中发挥的作用及是否特异性表达于淋巴管内皮细胞，近年仍有争议。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　收集西安交通大学医学院第一附属医院2006年3月～2007年5月手术切除的乳腺浸润性导管癌标本60例为研究对象，其中腋淋巴结转移的29例，无腋淋巴结转移的31例。肿块长径≤2cm 23例，>2cm且≤5cm 30例，>5cm 7例。按国际病理学分级标准Ⅰ级19例，Ⅱ级18例，Ⅲ级23例。所有患者均为女性，年龄(45.21±8.23)岁，术前均未接受放、化疗等其他治疗，均行乳腺癌改良根治术，清除淋巴结数目均大于15枚。取门诊乳腺纤维腺瘤手术标本15例作为对照。

　　1.2 试剂与方法

　　兔抗人VEGFC、VEGFR3多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；免疫组化染色SP试剂盒及DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。留取标本，石蜡包埋，4μm厚连续切片，按试剂盒说明(SP法)进行操作。行微波抗原修复，一抗工作浓度均为1∶100。PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知阳性的结肠癌组织切片作阳性对照。

　　1.3 结果判定

　　结果判定标准根据SHIMIZU法[1]改良而成：显微镜下细胞质显示棕黄色颗粒视为阳性着色。结合着色范围和染色强度进行半定量处理。在显微镜下(×200倍)随机选取5个视野，以阳性染色细胞占视野中所有细胞的百分比均值作为着色范围。着色范围积分：≤1%为0分，2%～20%为1分，21%～50%为2分，≥51%为3分。着色强度积分：无着色为0分，浅着色为1分，深着色为2分。上述两项积分为表达强度积分，≤1.9为阴性(-)，2～2.9为弱阳性(+)，3～3.9为阳性()，≥4为强阳性()。

　　1.4 统计学分析

　　实验数据由SPSS13.0统计分析软件处理。数值均以±s表示，计数资料比较使用χ2检验或Fisher确切概率法，计量资料采用t检验和单因素方差分析，采用Spearman法进行相关分析。显著性检验水平α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 VEGFC在乳腺组织中的表达

　　VEGFC主要表达于乳腺癌细胞胞质中，呈现淡黄色或棕黄色颗粒，细胞膜及细胞核未见染色(图1A、1B)。60例乳腺癌组织中43例可见VEGFC表达阳性，对照组仅2例可见胞质少量淡黄色颗粒(图1C)。乳腺癌组VEGFC表达的阳性率(71.7%)明显高于对照组(13.3%)，且差异有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌淋巴结转移组VEGFC表达的阳性率(86.2%)明显高于淋巴结无转移组(58.1%)，且差异有统计学意义(P<0.05)。在不同月经状态、肿块大小、病理分级、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及HER2表达分组中VEGFC表达差异无统计学意义(P均>0.05，表1)。

　　乳腺癌组VEGFC表达程度积分值(2.55±1.61)明显高于对照组(0.27±0.70)，差异有统计学意义(P<0.01)。乳腺癌淋巴结转移组VEGFC表达程度积分值(3.17±1.28)高于淋巴结无转移组(1.97±1.68)，差异有统计学意义(P<0.01，图2)。VEGFC的表达与乳腺癌淋巴结转移呈正相关(r=0.369，P<0.01)。X

　　2.2 VEGFR3 在乳腺癌组织中的表达

　　VEGFR3主要表达于乳腺癌癌巢周围间质组织中，呈现大片淡黄色或棕黄色染色，癌细胞胞质未见着色(图3A、3B)。部分VEGFR3强阳性染色集中于乳腺癌淋巴结转移阳性组的淋巴管内皮细胞及一些血管内皮细胞(图3C)。15例对照组仅2例可见间质组织中轻微黄染。乳腺癌VEGFR3表达阳性率(68.3%)明显高于对照组(13.3%)，差异有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌淋巴结转移组VEGFR3表达阳性率(82.7%)高于淋巴结无转移组(54.8%)，具有统计学差异(P<0.05)。在不同月经状态、肿块大小、病理分级、雌孕激素受体及HER2表达分组中，VEGFR3表达无显著性差异(均P>0.05，表1)。表1 VEGFC/VEGFR3与乳腺癌临床、病理相关参数的关系（略）

　　乳腺癌组VEGFR3表达程度积分值(2.35±1.64)明显高于对照组(0.27±0.70)，有统计学差异(P<0.01)。乳腺癌淋巴结转移组VEGFR3表达程度积分值(3.10±1.42)高于淋巴结无转移组(1.65±1.52)，有统计学差异(P<0.01，图4)。VEGFR3的表达与乳腺癌淋巴结转移呈正相关(r=0.433，P<0.01)。

　　2.3 乳腺癌VEGFC与VEGFR3表达的关系

　　乳腺癌组VEGFC与VEGFR3均阳性41例，VEGFC阳性VEGFR3阴性2例，二者均阴性17例，VEGFC与VEGFR3的表达呈高度正相关关系(r=0.848，P<0.01)。

　　3 讨 论

　　VEGFC是血管内皮生长因子家族的一员，是人类发现的第一种促淋巴管生成因子。VEGFR3属于内皮受体型酪氨酸蛋白激酶，为VEGFR家族成员。VEGFR3在胚胎时期主要表达在淋巴管丛胚胎静脉发芽处[2]，但在胚胎发育后期以及正常成体中，多数文献显示VEGFR3几乎特异性地表达在淋巴管内皮细胞上[3]。研究认为肿瘤细胞分泌出VEGFC，经丝氨酸蛋白纤溶酶等蛋白酶作用水解，形成VEGFC的活性形式，与表达于淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR3的亲和力可增加400倍[4]，VEGFC与VEGFR3结合后迅速被磷酸化，诱导下游的信号传导，例如激活VEGFR3引起Shc磷酸化和ERK1及ERK2的活化，引起淋巴管内皮细胞增生，从而使淋巴管增生或扩张，加大肿瘤淋巴道转移的机会[5]。

　　本实验结果显示，乳腺癌VEGFC、VEGFR3表达阳性率及表达程度均明显高于对照组。VEGFC主要表达于乳腺癌细胞的胞质中，VEGFR3主要表达于乳腺癌癌巢周围间质组织中，强阳性染色集中于乳腺癌淋巴结转移阳性组的淋巴管内皮细胞及一些血管内皮细胞。最近很多学者报道VEGFR3存在于肿瘤细胞株及实体肿瘤瘤细胞内[6]，LONGATTO等[7]研究发现VEGFR3表达于乳腺癌癌组织内，并不表达于淋巴管内皮细胞，关于VEGFR3在肿瘤淋巴结转移中发挥的作用及是否特异性表达于淋巴管内皮细胞仍需进一步研究。

　　VEGFC的高表达与多种实体瘤淋巴结转移及临床预后的相关性已有不少报道[812]。BEASLEY等[9]研究表明头颈部鳞癌、甲状腺癌中VEGFC蛋白表达水平与颈淋巴结转移呈正相关，VEGFC表达水平高者颈淋巴结转移率明显高于表达水平较低者。HUNG等[10]对甲状腺乳头状癌、髓样癌及正常甲状腺组织中VEGFC的表达进行对比研究，发现易发生淋巴道转移的甲状腺乳头状癌VEGFC蛋白表达显著高于正常组织，而易发生血管转移的髓样癌VEGFC表达则显著下降。可见VEGFC与肿瘤淋巴结转移关系更密切。SHIDA等[11]研究发现VEGFC表达促进胃癌淋巴结转移，国内关于胃癌亦有相似报道[13]。本研究显示，乳腺癌淋巴结转移组VEGFC、VEGFR3表达阳性率及表达程度均明显高于淋巴结无转移组，VEGFC、VEGFR3表达与乳腺癌淋巴结转移状态呈明显正相关；同时发现，VEGFC与VEGFR3的表达亦呈正相关关系。可见VEGFC、VEGFR3表达促进乳腺癌淋巴结转移，可能通过VEGFC、VEGFR3二者的相互作用，促进淋巴管增生来实现，与大多数文献报道一致。表达于淋巴管内皮细胞的VEGFR3促淋巴管生成的机制，可以由VEGFC/VEGFR3信号途径解释[14]，大量表达与乳腺癌癌巢周围间质的VEGFR3如何发挥其促淋巴管生成作用，尚待研究。
　　
　　越来越多临床病理学和动物模型的证据表明，VEGFC/VEGFR3在诱导肿瘤淋巴转移过程中发挥重要作用，因此阻断VEGFC与其受体VEGFR3的结合，进而抑制肿瘤淋巴转移，将成为肿瘤治疗的新途径，有待于进一步研究。

参考文献

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