益肾胶囊对狼疮性肾炎大鼠的治疗作用

　　　　 作者：吴喜利，张王刚，孙万森，乔成林，张晓强

【摘要】 目的 探讨益肾胶囊对狼疮性肾炎(lupus nephritis， LN)大鼠的治疗作用及其作用机制。方法 观察益肾胶囊组大鼠肾功能、24h尿蛋白(PRO/24h)的变化，分别采用双抗体夹心酶联免疫吸附法及放射免疫法检测血清Th1/Th3细胞因子(IL2、IL10、TGFβ1、IL6、TNFα)水平的变化和光镜观察肾脏病理形态学的改变。结果 经过6周的治疗，益肾胶囊组及强的松组大鼠肾功能、24h尿蛋白及血清IL6、IL10、TGFβ1、TNFα水平与模型组比较均明显降低，IL2明显升高(P<0.05或P<0.01)，且益肾胶囊组大鼠肾功能、24h尿蛋白及血清IL6、TGFβ1、TNFα水平明显优于强的松组(P<0.05或P<0.01);益肾胶囊组及强的松组肾脏病理改变均有不同程度的改善，两组比较无明显差异。结论 益肾胶囊可明显降低LN大鼠24h尿蛋白和改善肾功能，其作用机制可能与调节血清Th1/Th3细胞因子网络平衡及减轻肾脏病理损害有关。

【关键词】 益肾胶囊;狼疮性肾炎;肾功能;24h尿蛋白;Th1/Th3细胞因子

　　ABSTRACT: Objective To investigate the therapeutic effect of Yishen Capsule on lupus nephritis (LN) in rats and its mechanism. Methods We observed the changes of renal function and proteinuria /24h of LN rats in Yishen Capsule group. At the same time， Th1/Th3 cytokines (IL2， IL10， TGFβ1， IL6 and TNFα) in blood serum were measured by double antibody sandwichELISA and radioimmunity， respectively. The pathological changes of the kidney were observed by light microscope. Results After six weeks treatment， renal function， proteinuria /24h as well as serum levels of IL6， IL10， TGFβ1 and TNFα were decreased and IL2 was increased significantly in Yishen Capsule group and prednisone group compared with those in the model group (P<0.05 or P<0.01). Renal function， proteinuria /24h， serum levels of IL6， TGFβ1 and TNFα were better in Yishen Capsule group than in prednisone group (P<0.05 or P<0.01); there was some degree of amelioration in renal pathological changes， but with no differences in both treatment groups. Conclusion Yishen Capsule can lower proteinuria /24h and improve the renal function of LN rats， the mechanism may be related to regulating the balance of Th1/Th3 cytokine network and alleviating the renal pathological lesion.

　　KEY WORDS: YiShen Capsule; lupus nephritis; renal function; proteinuria /24h; Th1/Th3 cytokine

　狼疮性肾炎(lupus nephritis， LN)是一种继发性慢性肾小球肾炎，是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus， SLE)最常见和严重的内脏损害，其损害的程度直接影响着SLE患者的预后。随着糖皮质激素(下简称激素)联合细胞毒药物在LN中的应用，其预后已有了较大的改观。但治疗过程中药物的不良反应亦严重影响了疗效的取得及患者对治疗的耐受性。因此，从中医理论出发，结合现代医学来探讨LN的发病机制及治疗方法已成为该病研究的一个重要方向。 既往我们已从临床和动物实验观察到复方中药益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者(chronic glomerulonephritis， CGN)具有明显减少CGN尿蛋白，降低血清IL6、IL8、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)水平[13]、调整T淋巴细胞亚群比例失衡、预防CGN复发[34]及修复受损的大鼠肾小球系膜细胞和抑制肾组织NFκB、PDGFβ的表达等作用[5]。为进一步探讨该药对继发性慢性肾小球肾炎的治疗作用及其作用机制，我们观察了益肾胶囊对狼疮性肾炎大鼠肾功能、尿蛋白定量及Th1/Th3细胞因子水平等的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 健康纯种雌性9周龄SD大鼠40只，体重(120±20)g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。取雌鼠40只，随机分为对照组(n=10)、模型组(n=10)、强的松组(n=10)和益肾胶囊组(n=10)。

　　1.2 试剂与药物 无水乙二胺(EDA，开封化学试剂总厂AR)、无碘碳化二亚胺(EDC，Sigma公司)、大肠杆菌内毒素(Sigma公司);强的松(天津天药药业股份有限公司生产，批号：0612132);益肾胶囊由西安交通大学医学院第二附属医院制剂室提供(陕药制字[2001]第1424号，由黄芪、党参、熟地、山芋、山药、仙鹤草、茯苓、泽泻、潼蒺藜等组成)，加水制成1mL含生药1.25g的药液，4℃冰箱保存备用。

　　1.3 狼疮性肾炎大鼠实验模型的建立与分组

　　1.3.1 阳离子牛血清蛋白(CBSA)按BorderWard制备[6] 无水乙二胺(EDA)134mL加双蒸水1000mL，再加6mol/L HCl 700mL (放冰水浴冷却至25℃)调整pH 4.75，加BSA 10g 溶于500mL双蒸水中，接着加无碘碳化二亚胺(EDC)3.6g，继续维持原温度与pH值，搅拌2h后加4mol/L醋酸缓冲液60mL，终止反应，在4℃双蒸水中透析48h，最后冷冻干燥为结晶粉末，放-20℃冰箱备用。

　　1.3.2 免疫的处理 预免疫采用大肠杆菌内毒素100u的CBSA 100共溶于75mL的0.4mol/L磷酸缓冲液，最终浓度为1.5mL中含大肠杆菌内毒素1μg和CBSA 1mg。每只鼠尾静脉注射1.5mL，7d后开始正式免疫。正式免疫的方法是鼠尾静脉每日注射CBSA 25mg(预先将1d的用量溶于磷酸缓冲液中使1.5mL溶液中含有25mg CBSA)，每周7次，共6周。

　　1.3.3 大鼠模型的建立及给药 从正式免疫开始，强的松组给予强的松悬浮液灌养[6.45mg/(kg·d)]，益肾胶囊组给予中药益肾胶囊悬浮液灌养[12.5g/(kg·d)]，对照组和模型组给予同等剂量的生理盐水灌养。每日1次，连续给药6周。

　　1.4 检测指标

　　1.4.1 24h尿蛋白定量的检测 实验开始后的第6周，用代谢笼收集24h尿液标本，应用美国生产的Miditron M型尿液自动分析仪进行检测。

　　1.4.2 肾功能的检测 于第6周末大鼠处死前由股静脉采血，4℃ 3000r/min离心10min，取1mL血清做肾功能测定。

　　1.4.3 相关细胞因子的检测 大鼠血清IL2、IL10、TGFβ1水平的变化采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)进行检测;血清IL6、TNFα采用放射免疫法测定。严格按照说明书操作，并由专门实验室工作人员进行检测。

　　1.4.4 肾脏病理形态学的观察 于实验结束后将全部大鼠放血处死，取肾皮质用100mL/L甲醛固定，逐级酒精脱水、浸蜡、包埋，常规切片4μm，常规HE、PAS染色，光镜下观察其病理学改变。

　　1.5 统计学处理 所有数据均以(±s)表示，采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 益肾胶囊对LN大鼠肾功能及24h尿蛋白定量的影响 模型组、益肾胶囊组及强的松组大鼠肾功能及24h尿蛋白与对照组比较，均有显著性差异(P<0.05或P<0.01);益肾胶囊组及强的松组大鼠肾功能及24h尿蛋白与模型组比较，均明显降低(P<0.05或P<0.01)，且益肾胶囊组明显优于强的松组(P<0.05，表1)。表1 益肾胶囊对LN大鼠肾功能及24h尿蛋白定量的影响

　　2.2 益肾胶囊对LN大鼠细胞因子水平的影响 模型组、益肾胶囊组及强的松组大鼠细胞因子水平与对照组比较，均有显著性差异(P<0.05或P<0.01);益肾胶囊组及强的松组大鼠血清IL6、IL10、TGFβ1、TNFα水平与模型组比较均明显降低，IL2明显升高(P<0.05或P<0.01)，且益肾胶囊组大鼠血清IL6、TGFβ1、TNFα水平明显优于强的松组(P<0.05或P<0.01，表2)。表2 益肾胶囊对LN大鼠细胞因子水平的影响

　　2.3 肾脏的病理改变 正常组：HE、PAS染色后光镜下见肾小球呈卵圆形。肾小球毛细血管壁内皮细胞、毛细血管基底膜、足细胞、系膜细胞、系膜基质、肾小球囊壁上皮细胞、囊壁基底膜、肾小球囊腔清晰;肾小管上皮细胞、基底膜、肾小管腔清晰;模型组：肾小球增大并可见明显的毛细血管基底膜弥漫性增厚，毛细血管基底膜增厚呈双轨状，致毛细血管壁增厚，血管腔狭窄，部分毛细血管小叶边缘呈小结节状(毛细血管球呈分叶状);系膜细胞也可见增生，未见毛细血管内皮细胞及足细胞增生，也未见毛细血管壁坏死、血管腔内玻璃样血栓及炎细胞浸润，未见毛细血管壁塌陷，肾小囊内未见渗出物及新月体形成。肾小管：近端小管可见小管上皮变性、坏死，小管基底膜完好，近端小管及集合管内可见蛋白，细胞管型;益肾胶囊组及强的松组：以上各病变皆有不同程度的改善，两组比较无明显差异(图1，图2)。

　　3 讨 论

　　系统性红斑狼疮是一种异常免疫调节和自身抗体过量产生引起的以T、B细胞异常活化和病理性自身抗体过量产生为特征的自身免疫性疾病。有研究发现LN患者及动物模型体内存在着明显的细胞因子网络失衡，并证实Th1/Th3型细胞因子网络失衡在LN的诱导发生和发展中起关键作用[78]。由于对不同的研究对象，所报道的细胞因子分泌异常的表现不尽一致。Th1细胞主要分泌IL2、IFNγ、TNFα等细胞因子，而Th3细胞主要产生IL4、IL6、IL10和TGFβ等细胞因子[9]。大量研究证实，Th1和Th3型细胞因子为一对重要的调节因子，同时又互为抑制因子[10]。它们通过相互诱生、相互调控、受体表达以及生物学效应的相互影响(增强与拮抗)，组成了免疫微环境中的特殊的细胞因子网络(cytokines network)，共同参与机体免疫和炎症反应，在狼疮性肾炎的发生、发展和转归中起着十分关键的作用。但是，关于细胞因子网络在狼疮性肾炎发病中的具体作用机制还不明了，因此从细胞因子网络角度探讨狼疮性肾炎的作用机制及有效的治疗药物对于LN的治疗和预后有着重要的临床意义。

　　IL2主要由CD4+及少量CD8+ T细胞产生，参与免疫应答和免疫调节，如诱导抗原特异性Th1细胞增殖分化成效应细胞等[11];IL6主要由单核巨噬细胞、血管内皮细胞等产生，参与T细胞活化，是前炎症因子;IL10是一种主要来源于Th3细胞亚群，具有很强免疫抑制及免疫调控作用的细胞因子[12]，在临床上与炎症疾病、自身免疫性疾病以及移植等多种疾病密切相关。ISHIDA等[13]研究发现IL10的抗体可使狼疮鼠病情有效缓解，死亡率下降。TNFα是前炎症因子，主要由活化的单核吞噬细胞产生，直接或间接诱导IL6的表达，并可能是IL6过分表达的因子之一。有实验证实，TNFα在自身免疫性疾病中是造成病理性损害的主要原因之一[14]。TNFα mRNA肾脏局部表达量的增加可能会引起肾脏功能和结构多方面的改变，在LN向肾小球硬化的发展过程中起一定作用[15]。TGFβ1是目前公认的肾脏致纤维化因子，许多进展性肾病包括LN均以TGFβ1持续、过度表达为特征[16]。它可直接或间接地促使Ⅰ型、Ⅳ型胶原等细胞外基质的合成与积聚，诱导炎症细胞的浸润、成纤维细胞的积聚和血管的生成，可抑制MRL/lpr狼疮小鼠宿主抗革兰阳性和阴性细菌感染的能力;可下调IL2介导的T细胞增生信号传导而抑制其增生等。

　　因此，调节Th1/Th3细胞因子网络失衡将为LN的治疗提供一种有效的治疗方法。本研究结果显示，益肾胶囊组及强的松组大鼠肾功能及24h尿蛋白与模型组比较均明显改善 (P<0.05或P<0.01)，且益肾胶囊组明显优于强的松组(P<0.05)。说明益肾胶囊对狼疮性肾炎具有明显的治疗作用;益肾胶囊组及强的松组大鼠血清IL6、IL10、TGFβ1、TNFα水平与模型组比较均明显降低，IL2明显升高(P<0.05或P<0.01)，且益肾胶囊组大鼠血清IL6、TGFβ1、TNFα水平明显优于强的松组(P<0.05或P<0.01)。提示益肾胶囊治疗狼疮性肾炎的作用机制与该药具有调节细胞因子网络失衡有密切的关系。

参考文献

　　[1]吴喜利，孙万森，乔成林，等. 益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者尿蛋白及免疫功能的影响 [J]. 广州中医药大学学报， 2004， 21(2):100103.

　　[2]吴喜利，乔成林，孙万森，等. 益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者尿蛋白及NK细胞的影响 [J]. 第四军医大学学报， 2003， 24(17):15191519.

　　[3]吴喜利，孙万森，张王刚，等. 益肾胶囊对系膜细胞增殖性肾小球肾炎大鼠肾脏NFκB及PDGFβ表达的影响 [J]. 西安交通大学学报(医学版)， 2007， 28(3):293296.

　　[4]WU XL， SUN WS， ZHANG WG， et al. Study on effect of Yishen Capsule in preventing recurrence of chronic glomerulonephritis [J]. Chin J Integr Med， 2007，13(3):215218.

　　[5]吴喜利，孙万森，张王刚，等. 益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者血清血管内皮生长因子及细胞免疫的影响 [J]. 中国中药杂志， 2007， 32(21):103105.

　　[6]李荣山. 现代肾脏病实验技术 [M]. 北京：军事医学科学出版社， 2006:116118.

　　[7]梁科，刘华锋，廖丽琼，等. 狼疮肾炎患者Th1/Th3细胞因子失平衡状况的研究 [J]. 中华风湿病学杂志， 2004， 8(11):671675.

　　[8]李非，白雪源，陈香美，等. 利用基因芯片探讨中药复方对MRL/IPr狼疮小鼠肾基因表达及Thl/Th3细胞的调节作用 [J]. 中国西医结合">中西医结合杂志， 2003， 23(3):198201.

　　[9]何广胜，周玲，吴德沛. Th1和Th3细胞的分化调节机制 [J]. 中华血液学杂志， 2005， 26(2):125128.

　　[10]王宏天，樊均明. 细胞因子在系统性红斑狼疮和狼疮性肾炎中的作用 [J]. 国外医学·泌尿系统分册， 2005， 25(4):529532.

　　[11]蔡美英. 医学免疫学 [M]. 北京：科学技术出版社， 2002:5053.

　　[12]张道杰，段朝霞. IL10研究进展 [J]. 国外医学·免疫学分册， 2003， 26(1):3941.

　　[13]ISHIDA H， MUCHAMUD T， SAKAGUCHI S， et al. Continuous administration of antiinterleukin antibodies delays onset of autoimmunity in NZB/WF mice [J]. J Exp Med， 1994， 179(1):305310.

　　[14]KOLLIAS G， KONTOYIANNIS D. Role of TNF/TNFR in autoimmunity: specific TNF receptor blockade may be advantageous to antiTNF treatments [J]. Cytokine Growth Factor Reviews， 2002， 13(4):315321.

　　[15]周平，陈学荣，李世荫，等. 胰岛素样生长因子、白介素1和肿瘤坏死因子α基因在自发狼疮肾炎小鼠肾脏中的表达 [J]. 中国皮肤性病学杂志， 1999， 13(4):201202.

　　[16]GRANDE JP. Mechanism of progression of renal damage in lupus nephritis Pathogenesis of renal scarring [J]. Lupus， 1998， 7(9):604610.