侵袭性肺部真菌感染实验室诊断研究进展

【关键词】 侵袭性肺部真菌感染;病死率;实验室诊断

　随着社会老龄化、抗生素的滥用、激素及免疫抑制剂的长期使用、骨髓及器官移植的广泛开展，侵入性治疗手段的不断增多和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的流行，侵袭性真菌感染的发病率正在迅速增长，严重地威胁人类的健康与生命安全，已成为住院患者感染及死亡的主要原因之一〔1〕，同时，感染的真菌谱也发生了改变，以往真菌感染常见的白色念珠菌有所下降，而非白色念珠菌及曲霉菌感染呈上升趋势〔2，3〕。其中，侵袭性肺部真菌感染(IPFI)占深部真菌感染的首位，约50%～60%侵犯支气管、肺〔4〕。一些慢性病生存时间的延长，使IPFI的发病率增加，病死率高〔5〕。在临床诊疗实践中，由于IPFI的早期诊断相当困难，治疗时机也存在较大分歧，已成为日益严重的临床问题。

　　1 基本概念

　　IPFI是指真菌引起的支气管肺部真菌感染，即真菌对气管、支气管和肺部的侵犯，引起气道黏膜炎症和肺部炎症肉芽肿，严重者引起坏死性肺炎，甚至血行播散至其他部位。IPFI分为原发性和继发性两种类型，前者指免疫功能正常、有或无临床症状的肺部真菌感染;后者指伴有宿主因素和(或)免疫功能受损的肺部真菌感染，在临床上较为常见。播散性肺真菌病(disseminated pulmonary mycosis)：指侵袭性肺真菌病扩散和累及肺外器官，或发生真菌血症，与原发于肺的系统性真菌病(systemic mycosis)大体同义。

　　2 实验室诊断

　　IPFI临床上诊断困难，治疗棘手，危害很大。因此，感染的早期检测与鉴定十分重要。IPFI的真菌学检查主要包括以下几方面：直接涂片染色镜检、真菌培养检查、组织病理学检查、免疫和生化方法检测、分子生物学方法检测、抗真菌药物的药敏试验等。

　　2.1 直接涂片染色镜检 真菌学检查最经典的方法，具有快速、简便的特点。直接显微镜检结果对于荚膜组织胞浆菌病、皮炎芽生菌、粗球孢子菌、卡氏肺孢菌(P.jiroveci)或马尼菲青霉具有确诊意义。如肺组织中见到具有分隔的呈锐角分支的菌丝成分时，则可以首先考虑曲霉感染〔6〕。但痰标本涂片找到条件致病性真菌不能轻易诊断为肺部感染，还应结合其他临床情况才能考虑诊断。因此，直接涂片染色镜检对IPFI的诊断作用有限。而支气管肺泡灌洗液、经纤支镜防污染毛刷或经环甲膜穿刺取出的标本进行直接涂片检查，对早期诊断肺部真菌感染有重要意义。

　　2.2 真菌培养检查 除了能直接观察到病原菌生长，明确致病菌种外，还可做药敏实验，指导临床合理用药。一般用痰液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、活检组织、血液标本等作培养。通常血培养分离出念珠菌属、新型隐球菌、组织胞浆菌和镰刀霉菌具有临床意义，但如分离出曲霉属(非土曲霉)和青霉属(非马尼菲青霉)则常无临床意义。支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、活检组织标本培养出真菌可作出诊断，并可做菌型鉴定，以利临床的诊断和治疗。痰培养阳性对真菌感染的诊断只有参考价值，不能作为真菌感染的确诊标准。但合格痰液培养新生隐球菌阳性，或发现肺孢子菌包囊、滋养体、囊内小体则有临床意义，因为在气道内很少有隐球菌和肺孢子菌的定植。目前为改进传统培养方法耗时长，敏感性低的缺点，许多学者致力于研究更快速、准确鉴定侵袭性真菌感染的培养方法，并取得了很大的成效。

　　2.2.1 快速鉴定培养方法〔7〕 包括:①吐温酵母肉汤培养基(TYB培养基):利用白色念珠菌在人血清中形成芽管这一特点，30 min可判定结果。②特异性酶法:有甲基伞形酮N乙酰βO氨基半乳糖苷(MUAG) Candi试剂盒和Albistrip试剂条3～5 min可以检测白色念珠菌。Niimi等〔8〕利用部分真菌具有一种水解酶βN乙酰氨基己糖苷酶活性，用对硝基苯N乙酰βD氨基葡萄糖苷作底物检测此酶。在微量滴定板中进行的这一反应可将白色念珠菌和都柏林念珠菌与其他菌种分离开来。③糖同化实验:使用Rosco诊断试纸条4 h可鉴定光滑念珠菌。④吐温80浊度实验:可鉴定致病性念珠菌。

　　2.2.2 自动血培养系统〔9〕 从血液中分离培养出致病真菌是诊断真菌血症的最可靠方法，由计算机控制的全自动连续检测系统，使血培养方法更简单、快速、准确。主要有3类:①采用光电原理监测的血培养系统:利用微生物代谢过程中产生的CO2，引起pH及氧化还原电位改变，用光电比色法可判断有无微生物生长。包括BacT/Alert系统、Bactec9000系列、vital系统及BioArgos系统，10～15 min检测一次培养瓶。②检测培养基导电性和电压为基础的血培养系统:利用微生物繁殖可致培养基导电性或电压变化来判断有无微生物生长，包括Malthusll2L微生物生长分析仪及Sentinel系统，10～15 min测试一次培养基导电性。③应用感压原理的血培养系统:利用真菌生长过程中产气或吸气致血培养瓶压力变化来判断有无微生物生长，包括电子稳定程序(ESP)系统和灵敏的自动化菌血测试(OASIS)系统，24 min内检测一次培养瓶压力变化。

　　2.3 组织病理学检查 肺组织活检病理学检查对IPFI具有确诊价值。包括常规镜检(需用各种染色)、直接免疫荧光检查和原位杂交。通过经纤支镜肺活检、胸壁穿刺肺活检及开胸肺活检获取标本送病理学检查。见到菌丝和孢子等真菌结构，结合特殊染色，可以确定真菌感染的诊断。由于常规苏木素伊红(HE)染色标本中，真菌不易着色而难以发现，故特殊染色法对检出真菌病原体十分重要。利用荧光标记的肽核酸(peptide nucleic acid)探针与白念珠菌26 s rRNA进行原位杂交。可以快速鉴定血培养瓶中生长的白念珠菌。即荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)试验，可比常规方法提早24～48 h获知结果。

　　2.4 免疫和生化方法检测〔10，11〕 有补体结合试验、凝集试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法。常用ELISA方法测定血液、支气管肺泡灌洗液中的真菌抗原或抗体。如荚膜组织胞浆菌和新型隐球菌多糖抗原试验已在临床上广泛使用。新近开发的有：①半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)免疫试验：GM是曲霉属真菌细胞壁的特异性多糖，在曲霉菌感染的早期，用ELISA方法测定血液标本中的半乳甘露聚糖，敏感性是67%～100%，特异性达81%～98%。在支气管肺泡灌洗中亦可检测到GM，而且出现的比血液中早。因此测定支气管肺泡灌洗液中的GM有利于肺部曲霉菌感染的诊断。同时监测GM可对治疗效果进行评价，经过治疗后，GM在血液中的浓度明显下降〔12〕。在念珠菌感染时，用ELISA方法同时测定甘露聚糖和抗甘露聚糖抗体，两项中有一项指标阳性作为诊断的标准，敏感性为80%，特异性为93%，但是这种方法仍需进一步评价。但本试验结果可受到真菌感染部位、真菌释出GM的量、使用抗真菌药和某些抗菌药以及某些食物等因素的影响。2003年美国FDA 已批准该试验可用于造血干细胞移植受者和白血病患者中侵袭性曲霉病的诊断。但本试验结果可受到真菌感染部位、真菌释出GM的量、使用抗真菌药和某些抗菌药以及某些食物等因素的影响。但该试验在实体器官移植受者及儿童患者中的诊断价值未确立，其与侵袭性曲霉病预后的关系也尚未建立。②β1，3D葡聚糖(BG)试验：真菌的细胞壁由BG和甘露聚糖组成。因此测定血液、支气管肺泡灌洗液中的BG可作为诊断真菌感染的又一种方法。可在念珠菌属、曲霉属、毛孢子属、镰刀霉、枝顶孢属(Acremonium)、酵母属等所致侵袭性感染患者的血清中存在。美国FDA已批准该试验用于有侵袭性真菌感染症状或危险因素的患者血清作定性检测，作为深部真菌感染及真菌血症的辅助诊断，但应同时进行其他确证试验和真菌鉴定。其对曲霉菌感染的阳性预测值59%，阴性预测值为97%，但仍需临床进一步研究。

　　2.5 分子生物学方法检测 是目前真菌感染诊断中最活跃的一种方法，已有聚合酶链反应(PCR)扩增、分子探针、限制性酶切片段长度多态性分析 (RFLP)、DNA指纹图谱、随机扩增DNA多态性(RAPD)等方法，用于深部真菌病的诊断和分型研究，形成了以PCR技术为基础的一系列分子诊断方法〔13，14〕，该方法不仅能早期快速地确定真菌及其种属和分类，而且能监测真菌对治疗的反应。PCR技术可以扩增血清、血浆、全血、尿液、痰液、支气管肺泡灌洗液和脓液等标本中的真菌成分。近年用PCR扩增真菌的特异性rDNA片段，特异性100%，敏感性亦高(标本中含15个真菌即可检出)，不易与其他真核细胞交叉扩增。若从正常的无菌部位扩增出该序列，说明此处有真菌感染。但是标本的采集应当是无菌操作，以防污染。有报道〔15〕用PCR方法测定支气管肺泡灌洗液中的DNA片段有一定的假阳性。因此应结合临床作出判断。

　　2.6 抗真菌药物的药敏试验〔1〕 真菌的药敏试验在不断研究发展中。美国检验标准协会(CLSI)已批准酵母肉汤稀释法、酵母纸片扩散法可用于临床实验室，试验结果判断标准，见表1。表1 抗真菌药的判断标准

　　抗真菌药敏感试验结果与临床疗效的关系通常根据9060规则，即经药敏试验中敏感药物治疗的患者约90%有效，经耐药药物治疗后约60%的患者有效。目前泊沙康唑(posaconazole)、棘白菌素 (ecchinocandins)如卡泊芬净(caspofungin)、米卡芬(micafungin)药敏试验的判断标准尚未确定，抗真菌药对新型隐球菌药敏试验的判断标准也未确定。丝状真菌的药敏试验方法(稀释法)见NCCLSM38～A(2002)，但尚无判断标准以及需进一步建立其与体内疗效的关系。本方法适用于曲霉、镰刀霉、赛多孢菌属，接合菌属对伏立康唑(voriconazole)、泊沙康唑、雷夫康唑(ravuconazole)的敏感试验。

　　目前在临床应用的抗真菌药药敏试验产品有：①Sensititre yeastone显色平皿，已获美国FDA批准，适用于酵母的药敏试验;②E试验，24～48 h判读结果，适用于酵母和霉。据全球ARTEMIS酵母耐药性监测系统2005年中国临床分离株的监测数据(纸片法)，见表2。表2 中国酵母对氟康唑和伏立康唑的耐药率

　　3 结 语

　　随着IPFI病例的不断增加，各项检查技术也在不断改进和创新。同时，研制更广谱、更高效、更安全的抗真菌药物的步伐也在不断地加快，使患者得到早期诊治，早日康复提供了越来越有效的手段。

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