脑舒胶囊对Aβ25～35诱导的AD大鼠海马神经元氧化应激的保护作用

　　　　作者：秦大莲 岳永花 田吉 章卓 刘剑 顾立

【摘要】 目的 研究脑舒胶囊对Aβ25～35诱导的阿尔茨海默病(AD)大鼠海马神经元氧化应激的保护作用。方法 双侧脑室注射Aβ25～35复制大鼠AD模型;Morris水迷宫观察大鼠学习记忆能力;化学比色法检测海马组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;HE染色，光镜观察海马CA3区神经元损伤情况。结果 与对照组比较，AD模型大鼠学习记忆能力明显下降(P&<0.05)，海马组织GSHPx、SOD活性明显下降(P&<0.05，P&<0.01)，MDA含量明显增加(P&<0.05，P&<0.01);与模型组比较，脑舒胶囊治疗组大鼠学习记忆力明显改善，海马组织GSHPx、SOD活性明显升高(P&<0.05，P&<0.01)，MDA含量明显下降(P&<0.05，P&<0.01);光镜观察发现，模型组大鼠海马CA3区神经元排列紊乱，细胞数量减少;细胞体积变小，胞体形状不规则，胞浆浓缩，胞核固缩深染，结构不清，脑舒胶囊治疗组大鼠海马CA3区神经元上述情况明显改善。结论 脑舒胶囊对Aβ25～35所致AD大鼠海马神经元氧化应激具有较好的保护作用。

【关键词】 脑舒胶囊;大鼠;阿尔茨海默病;氧化应激

　β淀粉样蛋白(Aβ)是阿尔茨海默病(AD)患者脑中老年斑的主要成分。研究证明Aβ具有神经毒性〔1〕，Aβ产生神经毒性的具体机制至今尚未完全清楚，自由基损伤可能是Aβ的主要毒性机制之一。脑舒胶囊是我院多年用于“痴症”的验方，经加工制成的院内制剂，主要由人参、黄精、石菖蒲、郁金、葛根组成。现代药理研究表明，人参的主要成分人参皂苷Rg1能减轻Aβ25～35诱导的氧化应激对神经母细胞瘤细胞(SKNSH细胞)的损伤，改善AD大鼠的学习记忆障碍〔2，3〕。黄精总皂苷可改善小鼠学习记忆功能〔4〕，且具有较好的抗氧化损伤作用〔5〕。石菖蒲挥发油、β细辛醚、α细辛醚能改善各类型痴呆小鼠模型的学习记忆能力，抑制Aβ诱导的海马神经细胞凋亡和抗氧化应激损伤〔6〕。郁金和葛根素亦具有抗氧化应激，抑制Aβ诱导的PC12细胞损伤〔7〕。多年的临床观察发现，该方剂能较好地改善AD患者的临床症状。鉴于上述原因，本研究观察该方对AD大鼠学习记忆的改善及海马神经元的保护作用，为临床用药提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 6月龄雄性SD大鼠，体重240～260 g，川实动证第0716号(240115)，泸州医学院实验动物科提供。

　　1.1.2 主要实验药物与试剂 脑舒胶囊(Naoshu Capsule)：0.5 g/粒，含原生药 2.875 g/粒，批号：070603，泸州医学院药研所;脑复康：0.4 g/片，批号：060207，宜昌人福药业有限公司;β淀粉样蛋白：Aβ25～35，Sigma公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)试剂盒：南京建成生物公司。

　　1.1.3 主要实验仪器 脑立体定位仪(上海第二军医大学仪器厂);Morris水迷宫系统(成都泰盟科技有限公司); 722分光光度计(上海第三分析仪器厂);恒温水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公司);Olympus光学显微镜(日本株日会社)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验动物筛选、分组及给药 适应环境1 w后，以Morris水迷宫筛选学习记忆功能正常大鼠48只，随机分为生理盐水组(对照组，12只)、模型组(12只)、脑复康防治组(12只)和脑舒胶囊防治组(12只)。分组后第2天，用药组分别按0.72 g·kg-1·d-1脑舒胶囊和0.32 g·kg-1·d-1脑复康灌胃给药，每天1次，连续14 d。对照组和模型组给予等容量生理盐水。

　　1.2.2 AD模型建立 以无菌双蒸水配制浓度为Aβ25～35 2 μg/μl，置于37℃下孵育7 d，使其“老化”为具有神经毒性的聚集状态。0.4%戊巴比妥钠(0.04 g/kg)腹腔注射麻醉，模型组和用药组分别于左侧脑室和右侧脑室缓慢注入2.5 μl聚集态Aβ25～35，对照组侧脑室注射等容量的生理盐水。模型制备24 h后，继续给药14 d。

　　1.2.3 Morris水迷宫测试AD大鼠学习记忆能力 定位航行实验：大鼠造模后第14天，药后1 h进行。每天分上、下午两个时间段，每个时间段训练4次，每次分别从4个不同的标记点(在4个象限中平均分布)，将大鼠面池壁放入水中，记录120 s内寻找平台所需时间(逃避潜伏期)，每次至少间隔30 s，训练共历时5 d。如果大鼠在120 s内仍未找到平台，将其重新置于平台，20 s后移出迷宫，其潜伏期记为120 s。

　　空间探索实验：于定位航行实验结束的第2天进行。撤除平台，任选1个入水点将大鼠面池壁投入水中，记录大鼠在120 s内跨过虚拟平台的次数，在平台象限的游泳时间及在平台象限游泳距离占总游程的百分比。

　　1.2.4 样本制备 每组随机取8只大鼠腹主动脉取血后迅速断头取脑，冰盘上快速剥离脑膜，除去嗅球、延髓和小脑，分离双侧海马，滤纸吸湿后，称取海马脑组织湿重0.3 g左右，加入预冷的生理盐水，用匀浆器制成10%的组织匀浆，4℃离心10 min (3 500 r/min)，提取上清液，置- 20℃冰冻待检。每组另随机取2只大鼠，0.4%戊巴比妥(0.04 g/kg)麻醉后，以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液约250 ml灌注至大鼠全身僵硬，之后立即开颅取脑，置于盛有灌注液的小瓶备用。

　　1.2.5 海马组织匀浆样本检测 采用化学比色法测定SOD、GSHPx活性及MDA含量。

　　1.2.6 包埋、切片及染色 石蜡包埋，连续冠状切片，厚度为5 μm，每隔15张连续取2张，HE染色。具体操作按说明书进行。以海马CA3区锥体细胞层为观察对象，低倍镜(×100)下观察神经元的分布，排列及数量;高倍镜(×400)下观察神经元的形态学改变

　　1.3 统计学方法 计量资料用x±s表示。组间比较采用单因素方差分析后再SNK法检验，应用统计软件SPSS13.0。

　　2 结 果

　　2.1 脑舒胶囊对AD大鼠学习记忆能力的影响 定位航行实验：从表1可见，各组大鼠逃避潜伏期随着游泳天数的增加而不断下降，但第1、2天各组大鼠学习记忆能力无统计学差异。第3天、第4天和第5天模型组大鼠逃避潜伏期较对照组组显著增加(P&<0.01);脑复康组和脑舒胶囊组第4天和第5天的逃避潜伏期较模型组显著缩短(P&<0.05)。空间探索实验：从表2可见，模型组大鼠跨越平台的次数，在平台象限停留的时间和在平台象限游程占总游程的百分比较对照组明显降低(P&<0.01，P&<0.05);脑复康组和脑舒胶囊组大鼠上述指标较模型组有增加趋势，其中脑舒胶囊组大鼠跨越平台的次数显著增加(P&<0.05)。表1 大鼠定位航行实验及空间探索实验结果

　　2.2 脑舒胶囊对AD大鼠海马SOD、GSHPx活性和MDA含量的影响 从表2可见，模型组大鼠海马组织SOD活性较对照组显著降低(P&<0.01)，MDA含量较对照组显著增加(P&<0.01);脑舒胶囊组和脑复康组较模型组可提高大鼠海马组织SOD活性，降低MDA含量(P&<0.05)。

　　2.3 脑舒胶囊对AD大鼠海马CA3区锥体细胞损伤的影响 对照组(图1A)海马组织神经元呈带状分布，排列整齐，形态完整;细胞数量较多，细胞形态正常，体积较大，核居中，大而圆，染为淡蓝色，核仁核膜清晰，核仁染为紫色，胞质着色浅而均匀，尼氏体呈密集分布的细小颗粒状。模型组(图1B)神经元仍呈带状分布，但排列较紊乱，细胞数量减少;细胞体积变小，胞体收缩呈多角形或极不规则，胞浆浓缩，胞核固缩深染，结构不清。脑复康(图1C)和脑舒胶囊(图1D)组能改善上述神经元损伤，使海马神经元排列整齐较整齐，细胞数目明显增加，使胞浆浓缩，胞核固缩深染现象改善。表2 各组SOD、GSHPx活性和MDA含量

　　3 讨 论

　　近年来，自由基产生与清除失衡引发氧化应激在AD发病中的作用越来越受关注〔8，9〕。虽然，目前有学者认为AD患者的抗氧化治疗效果尚不肯定〔10〕，但Aβ在AD患者脑内沉积是不争的事实。Aβ本身或通过其他途径均可产生活性氧(ROS)，ROS可通过降低Na+，K+ATP酶的活性，改变膜的极性和流动性，亦可通过干扰L型电压依赖性Ca2+通道破坏细胞内钙的动态平衡〔11〕。此外，Aβ还能引起脂质过氧化、蛋白质氧化、DNA氧化及蛋白质的糖基化〔12〕，破坏SOD，从而降低细胞抵御氧化应激的能力。脑组织是体内氧负荷最大的器官之一，虽然人脑的重量仅占人体总重量的2%～3%，但却消耗了供应机体的20%的氧。与其他组织相比，脑部有着高的糖代谢和呼吸代谢，高浓度的不饱和脂肪酸组成脑神经元的膜结构，而且高浓度的反应铁离子和低浓度的抗氧化酶水平都使得脑组织更加容易受到ROS的损伤。另外，由于血脑屏障的存在，使得部分抗氧化物质不易透过，因而也使得脑组织对氧化应激特别敏感。Aβ引发的氧化应激损伤在AD发病中的具有重要作用，抗氧化治疗仍是AD治疗的重要措施之一。

　　Aβ25～35不仅可调节SOD和GSHPx活性，使氧化产物成倍增加，而且还可加强Fe2+所诱导的氧化作用〔13〕。鉴于此，本研究提示双侧海马注射凝聚态Aβ25～35诱导其局部沉积较好地复制了与自由基损伤有关的AD模型。

　　MDA是自由基引发脂质过氧化分解的最终产物，亦是导致AD神经元变性坏死的重要原因。SOD、GSHPx是体内重要抗氧化酶，其活性的高低反映机体对自由基的清除能力。它在细胞内能清除有害的过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化连锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。本研究结果提示脑舒胶囊可通过提高SOD和GSHPx活性，增加自由基清除，调节Aβ25～35所致自由基形成和清除失衡，从而减轻氧化应激对AD大鼠海马神经元的损伤，改善大鼠学习记忆力。

　　但最近研究报道〔14〕，海马星形胶质细胞较神经元更易受氧化应激损伤，我们的研究只观察了氧化应激对海马神经元的损伤而对胶质细胞损伤情况未作观察，二者损伤严重程度是否存在不同，对AD的发病有什么不同的影响，脑舒胶囊是否对此有干预作用均有待进一步研究。

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