结肠癌细胞源exosomes的分离鉴定及其表面蛋白CD44v6的表达

　　 作者：刘朋飞 朱磊 李响 孙一夫 石毅 丛登立 王浩天 周余来

【摘要】 目的 探索结肠癌colo205细胞系对exosomes的分泌功能，并分析热休克作用对表面蛋白CD44v6表达量的影响。方法 采用超速离心法分离colo205细胞分泌的exosomes和热休克处理后colo205细胞分泌的exosomes(Heat shocked exosomes，HSExo)，经220 nm微孔滤膜过滤纯化后，在透射电镜下观察其形态，并用SDSPAGE方法分析细胞与exosomes的蛋白组成，Western Blot检测表面CD44v6的表达情况。结果 经透射电镜观察，正常exosomes与HSExo形态基本相似，均为圆形或椭圆形膜性囊泡，直径大多在30～100 nm之间，且经热休克处理的colo205细胞及其分泌的HSExo，在CD44v6表达量上较正常colo205细胞及exosomes显著上调(P&<0.05)。结论 结肠癌colo205细胞系可分泌exosomes，且超速离心结合滤膜过滤的分离纯化方法切实可行;热休克作用可使CD44v6表达上调，说明HSExo较exosomes可能在肿瘤免疫治疗方面有更重要的应用价值。

【关键词】 结肠癌;exosomes;CD44v6;肿瘤免疫

　　外脂体是由细胞多囊体形成的一种膜性小囊泡，其来源十分广泛，其特异功能与来源细胞密切相关：外脂体携带着许多种独特的蛋白，如黏附蛋白，热休克蛋白等，在信号传导中起重要作用。作为一种免疫治疗的新手段，外脂体可以应用于肿瘤治疗。CD44v6是CD44 的一种拼接变异体，其表达可改变肿瘤细胞表面细胞黏附分子的构成和功能，有助于肿瘤细胞获得转移潜能，起到介导细胞间黏附、参与信号传递等作用，并与肿瘤的预后密切相关。目前，结肠癌外脂体肿瘤疫苗的研究才刚刚起步，主要是从LoVo、LS174T等细胞系中分离外脂体〔1，2〕，对其肿瘤免疫功能有较多的研究，但对结肠癌细胞分泌的外脂体表面相关蛋白的研究相对较少，尤其对其表面CD44v6的检测至今在国内外未见报道。因此，本课题组拟采用超速离心法从结肠癌细胞系中分离外脂体，对其表面分子CD44v6的表达水平进行检测，并分析热休克作用对CD44v6表达量的影响，为结肠癌亚细胞疫苗的研究及应用提供一定的理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料 RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、对钠十二烷基硫酸盐(SDS)均购自美国Sigma公司，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、预染蛋白Marker、均购自北京鼎国生物技术有限责任公司，硝酸纤维素转印膜购自美国PALL公司，鼠抗人CD44v6单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HPR)标记山羊抗小鼠IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、超敏化学发光(ECL)试剂盒购自碧云天生物技术研究所，人结肠癌colo205细胞株由吉林大学药学院生物工程实验中心提供。JEM2000EX透射电子显微镜购自日本电子公司、OptimaTM LE80K 低温超速离心机购自美国Beckman Coulter公司，Olympus IX70倒置显微镜购自日本Olympus公司。

　　1.2 结肠癌细胞的培养和热休克处理 实验选用结肠癌Colo205细胞株，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5% CO2条件下进行常规原代培养，待细胞长满培养瓶底80%后，拟提取exosomes，将培养细胞用不含小牛血清的RPMI1640洗涤2次，并继续培养48 h，台酚蓝染色检测细胞活力(细胞活力应大于97%)。此后，细胞于43℃孵育2 h，再于37℃恢复4 h〔3〕，倒置显微镜下观察细胞状态变化。

　　1.3 热休克源性exosomes(Heat shocked exosomes，HSExo)和非热休克源性exosomes的提取及纯化〔4，5〕 收集结肠癌细胞培养上清液，依次经300 r/min离心5 min、1 200 r/min离心20 min和6 000 r/min离心30 min，去除上清液中的细胞碎片等颗粒后，再以100 000 r/min离心60 min，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次。弃上清液，加入20 μl PBS重悬沉淀即为exosomes。-80℃冻存备用，使用前用0.22 μm滤膜过滤纯化。

　　1.4 电镜观察分析 取5 μl exosomes和HSExo，滴于载样铜网上，滤纸吸干液体，在滴加2%磷钨酸染液，负染1 min，待白炽灯烤干后约10 min，用透射电镜观察并照相。

　　1.5 结肠癌细胞及exosomes表面蛋白的分离 取经热休克处理和未处理的结肠癌细胞和相应的exosomes，分别放入细胞裂解液中，与冰上放置1 h，制得溶解物〔1〕。于100℃处理10 min，进行蛋白质变性，用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度。

　　1.6 Exosomes表面蛋白CD44v6的检测 设正常colo205细胞组、热休克处理的细胞组、正常外脂体组和热休克外脂体组，各组设3个复孔，经蛋白浓度检测后，各组以等量蛋白上样，进行8% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。电泳后将凝胶中的蛋白质通过湿法电转移方法，转移到硝酸纤维素膜上，并用含5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐溶液(TBS)封闭硝酸纤维素膜，37℃作用3 h，将鼠抗人CD44v6单抗用含5%脱脂牛奶的TBS以1∶1 000稀释，膜与一抗置于封闭塑料袋内，4℃过夜。用TBS洗膜3次，再与辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG 37℃下结合1 h，用TBS充分洗膜3次，经ECL化学发光试剂作用显色后，于暗盒内曝光，X光片显影定影后分析实验结果。

　　1.7 统计学分析 用Quantity one v4.62图像分析软件进行分析，结果以x±s表示，组内采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 热休克colo205细胞的观察 未经热休克处理的colo205细胞大多处于贴壁生长状态，少量悬浮生长;热休克处理之后悬浮细胞明显增多，但镜下未见形态学改变，见图1。图1 正常和热休克处理的colo205细胞(×200)

　　2.2 结肠癌colo205细胞源exosomes和HSexo的电镜观察 透射电镜下可见exosomes和HSexo大小不一，直径基本在30～100 nm之间，个别较大，二者形态基本相似，无明显差别，均为圆形或椭圆形膜性囊泡，并且在局部有相互聚集的倾向，见图2。

　　2.3 SDSPAGE结果 从SDSPAGE结果可见，在220 kD与105 kD之间，各样品组均在一定位置出现条带，但两个细胞组与两个exosomes组的条带位置有较大差异，而针对细胞组和exosomes组的组内比较条带位置差异并不显著。CD44v6的分子量约为190 kD，电泳结果显示在此区域有蛋白条带存在(1组为正常colo205细胞，2组为热休克colo205细胞，3组为正常外脂体，4组为热休克外脂体)。见图3。图2 exosomes和HSExo阳性图片(×100 000)图3 SDSPAGE结果

　　2.4 Western印迹结果分析 正常colo205细胞、热休克处理的细胞、exosomes和HSexo 4组经显影定影后均可见清洗条带。见图4。用Quantity one v4.62图像分析软件对Western印迹结果进行分析，结果显示经热休克处理后，CD44v6在细胞及exosomes上均出现了表达上调的现象(P&<0.05)。CD44v6阳性表达在colo205组为4.91±0.26，明显低于热休克colo205组(5.48±0.12);在exosomes组为5.05±0.24，明显低于HSexo组(5.80±0.15)(均P&<0.05)。图4 Western印迹结果

　　3 讨 论

　　肿瘤来源的exosomes(Tumor Exosomes，TEX)，在形态学、密度以及一些膜标志物的表达上与抗原提成细胞(APCs)来源的exosomes相似〔5〕。TEX中存在肿瘤抗原运载系统以及与细胞靶向性有关的蛋白(CD9)，这表明exosomes是一种抗原传递系统，能将肿瘤抗原转移到APCs。另外，TEX中含有许多肿瘤细胞所共有的共同抗原，TEX能将其转移到DC，导致交叉性呈递的CTL反应〔6〕。热休克反应是机体受到高温、缺氧、重金属离子、紫外线照射等理化因素的作用后，所产生的一种保护机体免受损伤的应激反应。热休克蛋白是在热休克反应作用下，启动热休克蛋白基因选择性合成的一组高度保守的蛋白质分子家族。近年来研究发现，人类肿瘤细胞中存在热休克反应，与肿瘤的生长、增殖及凋亡密切相关，表明热休克处理结肠癌细胞的方法，使细胞某些蛋白的表达上调，TEX中相应的蛋白含量也随之增加〔1〕;另外，热休克处理可以在一定程度上提高TEX的产量〔7〕。在本实验中，CD44v6表达上调的现象与相关研究一致，但并未发现热休克作用可提高结肠癌源TEX的产量，所以认为：不同细胞系的热休克反应往往有所区别，作用方式的差异常导致作用结果不尽一致，热休克处理不一定提高每种细胞系exosomes的产量。热休克作用会对exosomes产生影响，但作用机制还需进一步探索与研究。

参考文献

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　　3 刘 婷，华 川.树突状细胞抗肿瘤免疫的研究进展〔J〕.重庆医学，2009;38(16):20902.

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　　7 杨 麟，沈 宜，李 静，等.热休克小鼠肝癌细胞(h32)源Exosomes的制备及其蛋白组成的初步研究〔J〕.重庆医科大学学报，2008;33(6):66972.