作者：苏燕 邵国 雎天林 秦文斌
【摘要】 目的：观察鱼类血红蛋白与人血红蛋白及其相互之间的相互作用。方法：利用淀粉－琼脂糖混合凝胶交叉电泳的方法。结果：人血红蛋白穿过或兜过四种鱼类血红蛋白时并没有出现通常相互作用（简称互作）所观察到的“峰”或“谷”的改变。结论：鱼类血红蛋白与人血红蛋白之间没有互作，这一结果对了解血红蛋白的四级结构及分子进化都具有一定的意义。
【关键词】 鱼类；血红蛋白；相互作用；进化
Abstract Objective:To observe the interaction of fish Hb on human Hb. Methods: Agarose-starch mixed gel electrophoresis was used. Results:There was no "peak-like" or "valley-like" changes appearing while four different kinds of fish Hbs crossing human Hb. Conclusion: No interaction between fish and human Hbs. This will significantly contribute to understanding quarternary structure and molecular evolution of hemoglobin.
Key words Fish; Hemoglobin; Interaction; Evolution
以前，我们利用交叉电泳证明，在红细胞外，人血红蛋白Ａ2与血红蛋白Ａ可以发生相互作用［1］。后来推测，这种相互作用可能是各种血红蛋白之间的普遍规律。目前通过实验已经证实哺乳类中的家兔、大小鼠以及几种鸟类的血红蛋白均可同人血红蛋白发生相互作用［2－5］。为了进一步检验这种设想是否正确，我们选择市场上常见的四种鱼类：鲤鱼、鲫鱼、金鱼和泥蚯，用它们的红细胞制备溶血液，然后与人的红细胞溶血液进行交叉电泳实验，观察它们之间是否发生相互作用。
1 材料与方法
1.1 材料硼酸缓冲液（pH9.0），1×TEB缓冲液（pH8.6），氨基黑10B染色液，5%冰醋酸溶液。正常成人血样来自附属医院血库，各种鱼类血样来自水产品市场。
1.2 方法
1.2.1 新鲜鱼抗凝血的采集 采用心脏穿刺取血[1]，肝素抗凝。
1.2.2 溶血液制备 取人或鱼的抗凝血，离心除去血浆，然后用0.9%生理盐水（泥蚯用0.7%生理盐水）洗涤红细胞3～4次，最后向红细胞层加入1～1.5倍体积蒸馏水及0.5倍体积四氯化碳，激烈振荡后离心，取上层红色溶血液备用。
1.2.3 电泳分析 利用我室传统的淀粉-琼脂糖混合凝胶电泳。加样方法根据需要分为两种：单排加样，即在板的一端距边缘1.5～2cm处或中央并排加样，使加样线处于同一水平。双排加样，适用于快泳血红蛋白与相对慢泳血红蛋白之间的相互作用，具体又分为：穿过实验：前排（阳极侧）为一条长加样线，加慢泳血红蛋白，后排（阴极侧）为一短加样线，加快泳血红蛋白，相互拉开一定距离并在两边配上不交叉对照样品;兜过实验：前排（阳极侧）为一条短加样线，加慢泳血红蛋白，后排（阴极侧）为一长加样线，加快泳血红蛋白，相互拉开一定距离，并在两边配上不交叉对照样品。
1.2.4 染色方法及电泳结果的保存 将电泳完毕的胶板置于氨基黑10B染色液中染色1h后转入5％的冰醋酸中反复漂洗，直至胶板底色清亮透明，然后取出，观察结果、拍照、阴干保存。
2 结果
2.1 人血红蛋白与四种鱼类，即鲫鱼(Crucian carp)、鲤鱼(Common carp)、泥蚯(Loach)及金鱼(Goodfish)血红蛋白电泳位置的相对比较。使用淀粉-琼脂糖混合凝胶电泳，采用单排加样法，加样线位于板中央，样品均为溶血液，电压为6～8V/cm，电泳约3～4h，电泳结果见图1。
图1 人血红蛋白与四种鱼类血红蛋白电泳位置的相对比较 （略）
由此图可以看到鱼类血红蛋白与人血红蛋白相比具有如下特点：（1）四种鱼的血红蛋白组分及电泳行为各不相同，鲤鱼具有三种主要的血红蛋白组分，由阳极侧向阴极侧分别命名为HbCⅠ、HbCⅡ及HbCⅢ。泥蚯有两种主要的血红蛋白组分，它们对称地分别于加样线的阴阳极两侧，分别命名为HbP(Positive)和HbN(Nagative)。金鱼和鲫鱼均只有一个主要的血红蛋白组分。（2）四种鱼的血红蛋白与人血红蛋白Ａ相比均为相对慢泳血红蛋白，电泳速度比较为：人HbA&>泥蚯HbP &>金鱼Hb&>鲫鱼Hb=鲤鱼HbCⅠ&>鲤鱼HbCⅡ&>鲤鱼HbCⅢ&>泥蚯HbN。根据上述特点我们便可以选用适当的交叉电泳方法来分析各种血红蛋白间的相互作用。
2.2 鱼类血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用
2.2.1 鲤鱼血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用 分别采用双排穿过和兜过实验，让快泳人血红蛋白穿过或兜过相对慢泳鲤鱼血红蛋白。电压为6～8V/cm通电约5h左右，结果见图2。
图2 鲤鱼血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用（略）
由上述两图可见，人血红蛋白Ａ在穿过和兜过鲤鱼血红蛋白后，区带位置及形状均未发生变化，说明两者之间可能没有发生相互作用。
2.2.2 泥蚯血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用 分别采用双排穿过和兜过实验，加样线位于板中央，让快泳人血红蛋白穿过或兜过相对慢泳泥鳅血红蛋白。电压为6～8V/cm通电约5h左右，结果见图3。
图3 泥蚯血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用（略）
可见，人血红蛋白在穿过和兜过泥蚯的两个血红蛋白组分后，二者的血红蛋白电泳区带与对照相比均未发生改变，说明两者之间可能未发生相互作用。
2.2.3 鲫鱼血红蛋白与人血红蛋白间的相互作用 分别采用双排穿过和兜过实验，让快泳人血红蛋白穿过或兜过相对慢泳鲫鱼血红蛋白。电压为6～8V/cm通电约5h左右，结果见图4。
图4 鲫鱼血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用（略）
由以上两图可知，人血红蛋白在穿过和兜过鲫鱼血红蛋白后，二者的血红蛋白电泳区带与对照相比均未发生改变，说明人血红蛋白与鲫鱼血红蛋白之间可能也不存在相互作用。
2.2.4 金鱼血红蛋白与人血红蛋白间的相互作用 分别采用双排穿过和兜过实验，让快泳人血红蛋白穿过或兜过相对慢泳金鱼血红蛋白，结果见图5。
图5 金鱼血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用（略）
由以上两图可知，人血红蛋白在穿过和兜过金鱼血红蛋白后，二者的血红蛋白电泳区带与对照相比均未发生改变，说明金鱼血红蛋白与人血红蛋白之间可能也不存在相互作用。
3 讨论
在我们以前的实验中，已经明确证明，在电场中人血红蛋白A和A2可以发生相互作用，很可能是一种“一过性对称杂交”[1]。在此基础上，我们又发现人血红蛋白与一些哺乳动物如大小鼠、家兔等血红蛋白之间也有这种相互作用[2-4]。因此，我们曾设想，这种相互作用也许是各种血红蛋白间相互作用的普遍规律。但在按照原来计划进行鱼类血红蛋白与人血红蛋白相互作用的实验时，出现了与过去设想迥然不同的情况。在完全相同的实验条件下，同时比较研究了鸟类血红蛋白或鱼类血红蛋白与人血红蛋白的相互作用。实验结果表明，鱼类血红蛋白与人血红蛋白在相互穿过时均未出现以前见到的互作所特有的“波浪形区带”，说明两者之间可能没有发生相互作用。一系列实验和多次重复的结果，都一再证明二者在相互作用方面存在明显差异[5]。此项结果不支持作者以前关于“各种血红蛋白间都可能发生相互作用，即血红蛋白互作的普遍性”的设想，从而提出不同种类动物间血红蛋白相互作用可以有差异。在这种情况下，我们有可能提出一个血红蛋白分子进化方面的新问题。
过去谈血红蛋白的分子进化，多数是讲各种血红蛋白在氨基酸序列方面的同源性。进化过程相近者，同源性较大等。这些都属于一级结构或者化学结构范畴。现在，我们是从立体结构方面，特别是从相互作用、交换二聚体、一过性对称杂交方面进行比较研究，并且发现哺乳类、鸟类血红蛋白与鱼类血红蛋白之间存在区别。
现在可以认为，在生物进化过程中，特别是脊椎动物的进化过程中，鸟类和鱼类之间在血红蛋白分子进化方面存在一定的差异。我们的研究还在进行，初步实验证明，这个差异可能还要再深入到两栖类与爬行类之间。因此，我们推断，血红蛋白的互作可能在羊膜动物和非羊膜动物之间存在分水岭，这将给血红蛋白分子进化提供新的知识。
参考文献
[1] 秦文斌.红细胞外血红蛋白Ａ与血红蛋白Ａ2之间的相互作用[J].生物化学杂志，1991，7(5):583-585.
[2] 秦良谊，秦文斌.几种哺乳动物血红蛋白与人血红蛋白Ａ2之间的相互作用[J].生物化学杂志，1997， (专刊): 37.
[3] 孟峻，睢天林，秦文斌.家兔血红蛋白与人正常、异常血红蛋白之间相互作用的研究[J].生物化学杂志，1997，(专刊): 36.
[4] 武莎莎，秦文斌，睢天林.大小鼠血红蛋白与人正常、异常血红蛋白之间相互作用的研究[J].生物化学杂志，1997，(专刊): 37.
[5] 邵国，睢天林，秦文斌.几种鸟类血红蛋白与人血红蛋白之间相互作用的研究[J].包头医学院学报，2000，16(2):148.