siRNA沉默大鼠Robo2对培养DRGs神经元突起生长的影响

　　　　 作者：张海英，刘亦恒，赵久红，张显芳，劳梅丽，易西南

【摘要】 　　目的：观察沉默Robo2基因后对体外DRGs神经元突起生长的影响。方法：构建大鼠pSIH1H1copGFPRobo2 siRNA表达质粒，使用慢病毒（lentivirus）包装系统，在293T细胞中包装含Robo2 siRNA的慢病毒颗粒，然后转染DRGs神经元。实时荧光定量聚合酶链反应（RTFQPCR），Western blot检测Robo2 mRNA和蛋白的表达，显微镜下观察DRGs神经元突起生长情况。结果：RTFQPCR检测DRGs神经元中Robo2 mRNA的表达量，Robo组明显低于正常组，具有显著性差异（P&<0.01）。Western blot检测DRGs神经元中Robo2蛋白的表达量，Robo组明显低于正常组，具有显著性差异（P&<0.01）。Robo2 siRNA转入DRGs神经元的转导率为93.01%，与正常组比较，Robo2 siRNAlentivirus转导细胞（Robo）组轴突生长明显受到抑制。结论：Robo2蛋白是DRGs神经元轴突生长的重要导向分子，可促进轴突的生长。

【关键词】 DRG；Robo2；基因沉默；大鼠
　　
　　［ABSTRACT］ Objective: To observe the silencing Robo2 on growth of DRGs neuronal neurite. Method: Rattus Robo2 siRNA was synthesized and cloned into pSIH1H1copGFP plasmid. pSIH1H1copGFPRobo2 siRNA lentivirus was generated in 293T cells by pPACKH1TM Lentivector Packaging Kit and transducted into DRG neurons. Then，the Robo2 were tested by RTFQPCR and Western blot.Results: The expression of Robo2 mRNA and Robo2 protein in Robo2 siRNAlentivirus group were lower than the normal group. The transduction rate of Robo2 siRNA was 93.01% by lentivirus vector. Robo2 siRNAlentivirus group can efficiently suppress neurite growth compared with normal group.Conclusions: Robo2 can promote the growth of neurite of DRG.
　　
　　［KEY WORDS］ DRG; Robo2；Gene silencing；Rat
　　　
　　Roundabout （Robo）是一类与发育有关的保守跨膜受体家族，参与胚胎中枢神经轴突导向，促进树突分支、轴突生长，介导细胞迁移［1，2］。我们已报道成年大鼠背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）表达Robo及Slit，且周围神经损伤能改变DRG内Robo的表达，其中Robo1和Robo2表达增高［3］。Robo2是否参与了再生周围神经突起生长和导向？值得深入研究。本研究拟通过慢病毒载体，把针对Robo2基因的小干扰RNA（small interference RNA， siRNA）体外转染DRG 神经元，观察对DRG神经元Robo2表达及突起生长的改变。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养
　　
　　大鼠DRG 神经元的分离培养：SD大鼠由湖南农业大学实验动物中心提供。无菌条件下取新生1周龄SD大鼠背根节，F12冲洗组织数次后，于解剖显微镜下剥离被膜，置0.125%和0.25%胶原酶内各消化30min，接着移入0.25%胰酶继续消化15min，终止消化，在BSF2（含F12、1%N2和0.3%BSA）中吹打组织，900r/min离心5min，去上清，细胞重悬于含1mL BSF2的离心管内，在离心管底部添加2mL 15%BSA，900r/min离心10min，去上清，BSF2重悬细胞，置24孔板于CO2培养箱中培养。48h 后视细胞贴壁情况更换培养液。

　　1.2 试剂
　　
　　pSIH1H1copGFP shRNA vector（System Biosciences， US）、pPACKH1 Lentivector Packaging Kit（System Biosciences， US，LV500A1）、Trizol 试剂(Invitrogen， USA)、RTPCR试剂盒(Takata，Japan) 、Oligo dT（D511）、 Thermal Cycler DicerTM real Time System，Takara，Japan)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 大鼠Robo2 siRNA 表达载体的构建

　　采用pSIH1H1copGFP shRNA vector，将Robo2 siRNA 插入此质粒中，Robo2 siRNA 的序列为：5′ GCTGAGGGATTGTCAATAGA3′，阴性对照siRNA序列为：5′–CGATTAAGGGTCGCAAG A3′。

　　1.3.2 慢病毒(lentivirus)的包装生产

　　慢病毒包装系统采用 pPACKH1 Lentivector Packaging Kit（LV500A1），根据试剂盒操作指南，在 293T细胞中进行包装生产含Robo2 siRNA 的慢病毒颗粒。

　　1.3.3 慢病毒滴度的测定

　　梯度稀释法测定病毒滴度，在荧光显微镜下计数有荧光表达的细胞数目，将得到的数值(A)除以体积再乘以相应的稀释倍数就得到了病毒原液的滴度值，即：(A÷V)×10n。

　　1.3.4 慢病毒转染DRG 神经元

　　转导前1d，取DRG神经元以2×103个细胞接种到96孔细胞培养板，转导前对细胞进行换液处理，然后按照 MOI=30 添加病毒液，使用含10%胎牛血清的F12完全培养基，37℃和5% CO2的条件下，将细胞接种到6孔细胞培养板，使用不含抗生素的添加10%胎牛血清的BSF2培养基，在5% CO2和37℃条件下正常培养。转导后 96h，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，计数绿色荧光阳性细胞，确定转染率。实验分 3 组：（1）正常细胞组（Normal）；（2）阴性对照siRNAlentivirus转染组（Control）；（3）Robo2 siRNAlentivirus转染组（Robo）。

　　1.3.5 RTQFPCR检测Robo2 siRNA—Robo2 mRNA 的含量

　　取2μg总RNA，按RT—PCR试剂盒说明书进行操作，合成cDNA。RTPCR 检测所用引物：βactin， Forward primer：5′AGAGGGAAATCGTGCGTGAC3′，Rerverse primer：5′CCATACCCAAGGAAGGCT3′。Robo2，Forward primer: 5′AGTACAＡGTGCAGGGGTTGG3′，Rerverse primer：5′AGCAAGCCATＧＧATAACTGG3′。扩增片段为326bp。
　　
　　采用下列参数进行差异PCR：94℃，50；59℃，50；72℃，1min；5个循环后加入5mmol/LGAPDH上、下游引物混合液1μL，继续进行23个循环终止。
　　
　　采用Thermal Cycler DICE Real Time System analysis software对Ct值进行定量分析。

　　1.3.6 Western blot检测Robo2 siRNADRG 神经元Robo2蛋白的含量

　　取各组细胞，弃培养液，用预冷的PBS清洗3次，100mm平皿加200μL或300μL细胞裂解液，冰面上裂解20min，15000r，4℃离心10min，取上清液，Bradford法进行蛋白定量(Bio Radproteinassay)。以10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，半干电转移法转移至NC膜，室温下用封闭液封闭2h后加入一抗(Robo2)多克隆抗体，1∶250稀释； 4℃孵育过夜，抗兔IgG二抗（1∶1000稀释）反应2h，化学发光法显色，X射线底片曝光。实验重复3次，GAPDH作为内参照。

　　1.3.7 神经元突起生长的分析

　　慢病毒转染后培养96h，倒置显微镜下观察，各组随机选取10个视野，图像采用Axiovision软件测量并分析，计算神经元突起的长度（μm），同时，在荧光显微镜下，计数GFP阳性细胞数，并测量GFP阳性细胞突起长度。

　　1.4 统计学处理
　　
　　RTQFPCR检测结果Ct值和神经元突起长度数据用mean ± SEM表示。组间比较采用方差分析检验，两两比较用t检验，Ｐ&<0.05认为有统计学意义，统计软件采用SPSS 10.0版本。

　　2 结果
　　
　　2.1 Robo2 RNA干扰后，DRG 神经元 Robo2 mRNA的表达降低
　　
　　以看家基因βactin mRNA作为对照，RTQFPCR检测结果显示，Robo2 siRNA转入DRG 神经元后，Robo2 siRNAlentivirus转染细胞组的Ct值明显低于正常细胞组及阴性对照组（Ｐ&<0.05）（图1）。结果说明Robo2 siRNA能显著地降低DRG 神经元中Robo2 mRNA的表达。
注：Normal：正常细胞组；Control：阴性对照siRNAlentivirus转染细胞组；Robo：Robo2 siRNAlentivirus转染细胞组。与Normal相比较，**P&< 0.01。

　　2.2 Robo2 RNA干扰后，DRG 神经元 Robo2 蛋白的表达降低
　　
　　Western blotting检测结果显示，Robo2 siRNAlentivirus转染细胞组的Robo2 蛋白条带灰度不及正常细胞组及阴性对照组（图2）。说明Robo2 siRNA能降低Robo2蛋白在DRG 神经元中的表达。
　　
　　荧光显微镜下观察，转染96 h后，DRG神经元稳定表达GFP；通过活细胞计数和绿色荧光蛋白表达阳性细胞计数显示转染率为93.01%（图3 A、B、C、D）。正常细胞组细胞突起长度均值为（95.1 ± 21.54）μm， Robo2 siRNAlentivirus转染组细胞突起长度均值为（20.04 ± 5.1）μm，与正常组比较（P &<0.01）。Robo2 siRNAlentivirus转染组细胞突起明显缩短（图3 A、C、D、F），并且Robo2 siRNAlentivirus转染组中，GFP阴性细胞的轴突长度（箭头所示）明显长于GFP阳性细胞轴突，两两比较（P&<0.01）。Robo2 siRNAlentivirus转染阳性细胞突起缩短（图3 C、D、F）。Robo2 siRNAlentivirus转染组中，GFP阴性细胞的突起长度与正常组相比，无显著性差异（P&>0.05）。（图3 C、E、F）。

　　3 讨论
　　
　　Slit/Robo是一类新的排斥性导向分子系统。Robo作为Slit的受体介导Slit的排斥作用。Ozdinler等［4］发现阻断Robo的胞外域后，可阻断三叉神经轴突与Slit接触后促未成熟轴突的分支形成树突状外形的作用；而Robo的胞内域正是Slit/Robo结合后发挥功能的区域。我们在前期研究中也同样发现，在培养的DRG和DRG神经元中添加Slit1重组蛋白，可以增加神经元突起的长度，而添加Robo2重组蛋白，则抑制神经元突起的长度，这说明Slit1/Robo2在周围神经再生中发挥重要作用。为了进一步确认Robo在周围感觉神经再生中的作用，采用慢病毒构建Robo2 siRNA，通过Robo2 siRNAlentivirus干预DRG 神经元Robo2蛋白的表达，结果发现对DRG 神经元轴突生长有明显的抑制作用。本结果进一步证明了Robo2蛋白能够促进DRG 神经元突起的生长。
　　
　　目前基因转染载体主要分为非病毒载体和病毒载体。非病毒载体转对神经元的转到效率不高［5］。病毒载体常用的有反转录病毒、腺病毒和慢病毒等。尤其是慢病毒载体能高效感染分裂期和非分裂期细胞，并把基因整合到靶细胞，实现基因的长期稳定表达。Wang等［6］采用慢病毒转染视网膜小胶质细胞，干预组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA）的表达，发现慢病毒载体能高效感染神经细胞。本研究通过构建Robo2 siRNAlentivirus表达慢病毒载体，获得高滴度病毒载体，转染培养DRG 神经元96h后，结果显示对DRG 神经元的转染率可达90%，提示慢病毒载体转染神经元是一种较为可靠的方法。
　　
　　有人曾设计Robo1siRNA研究其功能［7］。受此启发，本研究其采用Invitrogen公司提供的 BLOCKiTTM RNAi Designer软件，设计针对Robo2mRNA序列的siRNA，观察其对体外培养的神经元中干扰的效应，在设计的近10个序列中，经RTQFPCR反复验证，发现5′ GCTGAGGGATTGTCAATAGA 3′这个序列转染效果最好。Western blot和形态学结果显示，此序列能显著降低Robo2蛋白表达，影响神经元突起的生长。
　　
　　本研究采用特异性siRNA沉寂Robo2，导致培养感觉神经元Robo2表达明显下降，但并未人为改变培养基中Slit的量，观察到转染阳性的神经元突起长度明显缩短，这一结果说明Robo之间通过同种亲和发挥着促神经生长作用，这与Hivert等［8，9］观察到的结果相吻合，后者认为Robo2和Robo1可能通过两者的相互结合，也可通过与Slit结合而促进神经突的生长。我们的结果与Hocking等［10］人的结果也是相吻合的，后者发现dnRobo2 和dnRobo3两者都能抑制视网膜节细胞轴突伸长，导致轴突生长方向错误。同时，这一结果也预示着可能通过改变Robo的表达来达到实现调控感觉神经再生的可能，因此，进一步的研究具有重要的应用意义。

参考文献

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　　8 Hivert B， Liu Z， Chuang CY， et al. Robo1 and Robo2 are homophilic binding molecules that promote axonal growth ［J］. Mol Cell Neurosci， 2002， 21(4):534545.

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　　10 Hocking JC， Hehr CL， Bertolesi GE， ea al. Distinct roles for Robo2 in the regulation of axon and dendrite growth by retinal ganglion cells ［J］. Mech Dev， 2010， 127(12):3648.