结缔组织生长因子单克隆抗体超微超顺磁氧化铁粒子的制备及其生物活性的研究

　　　　　　作者：吴媛，吴国球，刘乃　，张松，张宇

【摘要】 目的： 通过化学合成方法制作结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)单克隆抗体超微超顺磁氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)粒子分子探针，并检测其生物活性。方法： 采用EDC(1ethyl3[3dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)化学连接剂将CTGF单克隆抗体与DMSA[meso2，3dimercaptosuccinic acid(HOOCCH(SH)CH(SH)COOH)]修饰的USPIO相结合，形成具有免疫活性的分子探针。通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blotting方法检测其生物稳定性及免疫活性。结果： 随着加入不同质量的单克隆抗体，ELISA试验所得的吸光度值随抗体含量增加而增大，与阴性对照USPIO组相比较差异显著(P&<0.05)，分别间隔30 d及60 d后再次测量，只有200 μg单抗组吸光度值降低(P&<0.05)。Western blotting试验显示，结合单抗的USPIO及单纯单抗均显示出条带，且前者较浅，而单纯USPIO对照组则未显示条带。结论：EDC化学方法可制备出结缔组织生长因子单克隆抗体超顺磁氧化铁粒子，同时仍具有抗体的生物活性及生物稳定性。

【关键词】 超微超顺磁氧化铁; 结缔组织生长因子; 单克隆抗体; 生物活性

近年分子影像学应运而生，发展迅速，Weissleder等[1]将分子影像学定义为“在细胞和分子水平对生物学过程进行活体定性及测量的技术”。不断出现的各种分子探针，能观察代谢变化的分子成像技术，为阐明发病机制提供先进手段[24]。心血管系统的分子影像学探针的开发与应用体现出有用的价值，不同的靶向探针已开发用于不同的分子事件，如纤维蛋白、凋亡、血管生成等的成像[56]。超微超顺磁氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)作为探针直径小，能穿行于血管内皮细胞间隙，可用于血管分子成像[7]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)在心血管疾病的发生、发展中起重要作用，与动脉粥样硬化[8]、心肌梗死[9]、高血压[10]、血管形成[11]有关;同时是一种特异性更强的、选择性干预病理改变过程的细胞因子。本实验将其单克隆抗体与USPIO通过化学方法相结合可以达到在活体水平动态观察及测量的目的，对于研究心血管疾病的发展及早期诊断有着重要的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　DMSA修饰的USPIO(东南大学生物科学与医学工程系制备);重组CTGF及CTGF单抗(本实验室制备);辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠抗体，Biomat高吸附酶标板(上海晶美公司);EDC(美国Sigma公司);全自动洗板机(美国BioRad公司);蛋白质Marker(美国BioRad公司)，酶标仪(美国Sigma公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 CTGF单克隆抗体超顺磁粒子的制备 采用东南大学生物科学与医学工程系合成DMSA修饰的USPIO，直径为10～15 nm，质量浓度7.8 g·L-1。将其用去离子水冲洗3次，重悬于1 ml的PBS溶液中(0.1 mol·L-1，pH 5.6)，稀释至终质量浓度0.1 mg·ml-1，并经超声分散20 min。将新鲜配制的EDC溶液(10 mg·ml-1)加入USPIO的溶液中，在室温下轻晃5 min后再分别加入25、50、100、200 μg的单克隆抗体，将上述溶液混匀，于室温下轻晃反应2 h。结合上单抗的USPIO用永磁铁从溶液中分离，并用PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.0)冲洗3次。将结合单抗及同质量未结合单抗的USPIO，加入含有1%BSA的PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.0)溶液1 ml。37 ℃孵育2 h后弃去溶液，再用PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.0)冲洗3次。最后重新悬浮于1 ml PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.0)溶液中。

　　1.2.2 ELISA试验 取一定量CTGF抗原，用pH 7.2 0.1 mol·L-1的PBS稀释至适当浓度，包被96孔酶标板，100 μl·孔-1，4 ℃过夜。清洗3次后加入1%BSA的封闭液，200 μl·孔-1，37 ℃孵育2 h。清洗5次后分别加入结合上述不同浓度的单克隆抗体及未结合单抗的USPIO，50 μl·孔-1，37 ℃孵育1 h，清洗5次后加入一定稀释度的HRP标记的单抗，50 μl·孔-1，37 ℃孵育1 h。清洗5次后加TMB显色液A、B各50 μl·孔-1，37 ℃孵育15 min，加入终止液50 μl·孔-1，测得各孔A450 nm/A630 nm。

　　1.2.3 Western blotting试验 将CTGF及Marker加入到样品孔中，通过SDSPAGE凝胶分离，然后转印至PVDF膜上，之后用PBST溶液(1‰Tween20，0.1 mol·L-1，pH 7.4)漂洗，室温下用含有5%脱脂奶粉封闭2 h。分别将结合单克隆抗体100 μg的USPIO及未结合单抗的USPIO稀释10倍后与PVDF膜一起孵育，4 ℃过夜。PBST漂洗3次，置于摇床室温，每次10 min。加入用PBST稀释的二抗，与膜共孵育，置于摇床室温2 h。用PBST漂洗3次，置于摇床室温，每次10 min。滤纸吸干膜上的水分，将膜移至干燥的保鲜膜上，ECL液均匀滴加在PVDF膜上，用保鲜膜包住PVDF膜，放在夹板上，剪一张稍大于PVDF膜的胶片覆盖于膜，夹紧夹板，曝光后分别置于显影液、定影液中显影，即可观察条带。

　　1.3 统计学处理

　　用SPSS 15.0统计软件分析数据。计量资料以x-±s表示，统计分析采用oneway ANOVA进行显著性检验，若P&<0.05则差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 ELISA试验检测CTGF单克隆抗体超微超顺磁氧化铁纳米粒子及生物活性、稳定性 加入不同质量单克隆抗体(25、50、100、200 μg)与USPIO(0.1 mg)反应后，所得生成物于波长450 nm/630 nm处测得各浓度吸光度值分别为0.517±0.128、0.891±0.194、1.185±0.122、1.633±0.048。经统计学分析，PBST组与单纯USPIO对照组相比无显著差异(0.057±0.013 vs 0.088±0.020，P&>0.05);单纯USPIO对照组与不同质量各组相比，差异有统计学意义(P&<0.05)。不同质量单克隆抗体(25、50、100、200 μg)与USPIO(0.1 mg)反应后生成物，于PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.0)溶液中4 ℃保存30 d及60 d后，再次洗涤3次并重悬浮于1 ml PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.0)溶液中，于波长450 nm/630 nm处测得各浓度吸光度值，并求其平均值(n=3)，结果如图1。200 μg组0、30、60 d间吸光度值比较明显降低，差异显著(P&<0.05)，其余各组0、30、60 d间吸光度值比较无显著差异(P&>0.05)。

　　2.2 Western blotting检测生物活性结果

　　分别检测100 μg单克隆抗体标记USPIO组、100 μg单克隆抗体组及未标记单克隆的USPIO组，结果如图2，可见100 μg单克隆抗体标记USPIO组、100 μg单克隆抗体组于Marker大约相对分子质量30 000处显示条带，且单纯100 μg单克隆抗体组条带比较深，而未标记单克隆的USPIO组未见显影条带。

　　3 讨 论

　　分子影像学研究的3个关键问题(高度特异性的显像探针、合适的扩增方法以及高分辨率的成像系统)中，以分子影像探针的研究最为重要，也是进行分子影像学研究的先决条件。靶向探针由与靶具有亲和性的配体(如抗体、肽或小分子化合物)经特定的方法与同位素、荧光素、顺磁性复合物及声学对比剂连接组成。超顺磁性氧化铁纳米分子探针也因良好的生物相容性和MR信号敏感度而成为研究热点。根据不同研究目的可对USPIO选用不同转染介质进行修饰，本实验选取表面带有活性羧基的DMSA修饰的USPIO与单克隆抗体通过化学方法相结合制备分子探针。

　　抗体蛋白质通过两种吸附方式连接到磁纳米粒子表面，一种是以形成范德华力等物理吸附方式结合，另一种是以形成化学共轭键形式结合，而前者不稳定，易解吸。EDC是一种羧基和胺基反应的交联剂，它是目前用来合成蛋白质与磁纳米粒子最常用的化学方法。

　　在本实验中，EDC溶液可使螯合于USPIO表面的DMSA上的游离羧基活化，然后立即与抗体上的游离氨基形成酰胺结合。通过间接ELISA试验验证单抗是否结合至USPIO表面，同时证明生成物的免疫活性和生物稳定性。随着反应时加入单克隆抗体质量的增加，其生成物的吸光度值逐渐增高，且明显高于阴性对照组(USPIO)，表明单克隆抗体成功标记到USPIO上，且仍具有生物活性。同时分别将合成物于PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.0)溶液中4 ℃保存30 d及60 d后重新测吸光度值，发现200 μg组0、30、60 d吸光度值降低比较明显，其余各组无明显改变，与文献[11]报道相符，表明合成物具有生物稳定性，且100 μg左右的单克隆抗体能够充分以化学共轭键方式与0.1 mg DMSA修饰的USPIO相结合，以物理方式吸附的过量抗体易解吸下去。

　　与ELISA试验相比，Western blotting有更强的特异性，进一步明确了该合成物的生物免疫活性。实验结果显示，在重组CTGF相对分子质量大约为30 000处，合成物与单纯单克隆抗体组分别显现出了条带，且单抗组比标记单抗的USPIO组显色深，而未结合单抗的USPIO组则未出现对应条带，表明标记到USPIO上的单抗的生物活性与同质量的单抗相比有所下降，但仍然存在。

　　通过本实验结果表明，可以利用EDC化学合成方法成功合成CTGF单克隆抗体超顺磁氧化铁纳米粒子，同时证明该合成物上的抗体仍具有生物免疫活性及生物稳定性，可以进一步应用到体外及体内成像研究。

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