磁性纳米四氧化三铁协同顺铂作用于肺癌A549细胞的初步研究

【摘要】 目的： 检测磁性纳米四氧化三铁(NanoFe3O4)联合顺铂(DDP)作用于人源肺腺癌细胞A549后相关凋亡抑制基因、耐药蛋白的表达，研究其增强化疗敏感度的机制。方法： 用MTT法检测NanoFe3O4聚合DDP对A549细胞增殖凋亡的影响;流式细胞术分析凋亡细胞比例;RTPCR检测抗凋亡基因bcl2、survivin、ERCC1表达水平变化;蛋白印迹法分析耐药蛋白MRP及其表达率。结果： 25 μg·ml-1 NanoFe3O4能有效增强DDP的细胞毒作用，提高A549的凋亡率;与单独用药组相比，NanoFe3O4联合DDP组的抗凋亡基因bcl2、ERCC1和耐药蛋白MRP表达下调，差异具有统计学意义(P&<0.05);survivin基因表达未见明显改变。结论： NanoFe3O4联合DDP可通过下调抗凋亡基因bcl2、ERCC1及耐药蛋白MRP的表达，增强化疗药物敏感度。

【关键词】 磁性纳米四氧化三铁; 顺铂; 肺腺癌细胞系A549; 凋亡; 多药耐药

顺铂(DDP)是一种金属铂化合物，含有类似烷化剂的双功能基团，以顺铂为主的联合化疗已成为肺癌经典治疗方案[1]。但随之出现的化疗敏感度下降、肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)等问题，影响其疗效，降低了患者的生存率[2]。利用纳米载体聚合携载化疗药物逆转肿瘤细胞的多药耐药以增强化疗敏感度是一项探索性研究[3]。本实验通过检测磁性纳米四氧化三铁(NanoFe3O4)联合顺铂(DDP)作用于人源肺腺癌细胞系A549后相关凋亡抑制基因及耐药蛋白表达的动态变化，研究其增强化疗敏感度的机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人肺腺癌细胞系A549由南京军区总医院肿瘤中心惠赠，NanoFe3O4由东南大学生物科学与医学工程学院提供，DDP为购自南京制药厂的铂龙注射液(质量浓度1 mg·ml-1)，RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司，胰蛋白酶、MTT、DMSO试剂盒购自Sigma公司，AnnexinⅤFITC/PI试剂盒购自BD公司，bcl2、survivin、ERCC1及GAPDH基因引物由上海英骏生物科技有限公司合成，RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司，MRP抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。酶标仪为BIORED550型，流式细胞仪为美国BD公司FACS Calibur型。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 A549细胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每3～4 d传代1次。

　　1.2.2 MTT法检测细胞增殖凋亡效应 取对数生长期细胞接种于96孔板，每孔1.2×104个细胞，孵育过夜后，选取抑制效果最明显的25 μg·ml-1 NanoFe3O4作为药物干预浓度。设终质量浓度为2.5、5、10、20 μg·ml-1的DDP以及上述浓度的DDP合并25 μg·ml-1的NanoFe3O4组，另设空白调零组、阴性对照组以及NanoFe3O4组，每组设3个复孔，培养24 h，用MTT法测每孔吸光度值(A490 nm)。抑制率=(1-药物组平均A490 nm/对照组平均A490 nm)×100%。

　　1.2.3 Annexin Ⅴ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期的A549细胞，按处理条件分为A组(空白对照组)、B组(DDP组)、C组(DDP加NanoFe3O4组)和D组(NanoFe3O4组)。B组加5 μg·ml-1DDP，C组加5 μg·ml-1DDP和25 μg·ml-1NanoFe3O4，D组加25 μg·ml-1NanoFe3O4。加药24 h后收集细胞，PBS洗涤2次，采用AnnexinⅤ和PI荧光染色流式细胞术定量分析细胞凋亡率。

　　1.2.4 RTPCR检测抗凋亡基因bcl2、survivin、ERCC1表达 按上述分组处理收集细胞，Trizol法提取总RNA，按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RTPCR操作。bcl2：上游引物5′GGGAGAACAGGGTACG

　　ATAA3′，下游引物5′CCACCGAACTCAAAGAAGG3′，产物长度452 bp;survivin：上游引物5′CAAGGACCACC

　　GCATCTC3′，下游引物5′CCAAGGGTTAATTCTTCAA

　　ACT 3′，产物长度255 bp;ERCC1：上游引物5′CCG

　　CCAGCAAGGAAGAAA 3′，下游引物5′CTGCCGAGG

　　GCTCACAAT3′，产物长度276 bp;内参为GAPDH。RTPCR产物行琼脂糖凝胶电泳，数字成像系统拍照分析。

　　1.2.5 蛋白印迹法分析多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein， MRP)及其表达率 收集药物处理前后的细胞提取总蛋白。取样进行SDSPAGE电泳，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，用含1%牛血清白蛋白的TBST室温封闭4 h后，加入1∶1 500稀释MRP单抗，于4 ℃孵育过夜;TBST漂洗3次，加入二抗，37 ℃摇床温育2 h，系统显色。以等量内参蛋白作为对照，将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统分析。

　　1.3 统计学处理

　　实验所得数据以x-±s表示，利用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，多组间的比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 MTT法检测

　　MTT法检测结果显示：单纯25 μg·ml-1NanoFe3O4(D组)对A549细胞的生长抑制率与对照组(A组)相比差异无显著性(P&>0.05);随DDP浓度递增，A549抑制率逐渐增高。DDP联合NanoFe3O4的C组抑制率明显高于相应浓度DDP组(B组)，差异有统计学意义(P&<0.05)。见表1。表1 单用DDP或联合NanoFe3O4对A549细胞毒性作用

　　2.2 各组A549细胞凋亡率检测

　　根据MTT结果选取终质量浓度为5 μg·ml-1的DDP和25 μg·ml-1的NanoFe3O4干预细胞。A、B、C、D组细胞24 h的凋亡率依次为5.1%、46.5%、60.6%、5.0%(图1)。

　　2.3 bcl2、survivin、ERCC1等抗凋亡基因表达水平

　　在A549细胞中存在bcl2、survivin、ERCC1 mRNA的异常表达。以5 μg·ml-1的DDP和25 μg·ml-1的NanoFe3O4干预细胞，作用24 h后，bcl2、survivin、ERCC1 mRNA的表达情况见图2。以GAPDH灰度值为参照，经图像处理系统分析得出目的基因表达的半定量结果：DDP组、DDP加NanoFe3O4组与空白对照组比较，bcl2、ERCC1 mRNA表达有逐渐减少趋势(P&<0.05)，而NanoFe3O4组与空白对照组基因表达量比较差异无统计学意义。肺腺癌A549细胞表达survivin mRNA，但4组差异不具有统计学意义。

　　2.4 多药耐药蛋白MRP表达水平变化

　　SDSPAGE电泳显示，DDP组、DDP加NanoFe3O4组与空白对照组比较，MRP表达有逐渐减少趋势，且DDP加NanoFe3O4组与DDP组间MRP表达差异也具有统计学意义(P&<0.05)，见图3。

　　3 讨 论

　　耐药及凋亡相关基因的过度表达是MDR的重要发病机制。有学者将MRP、LRP等耐药蛋白所介导的MDR称为近端机制，凋亡介导的MDR称为远端机制[4]。包括bcl2、survivin、ERCC1在内的细胞凋亡相关基因在MDR中的作用以及两种机制之间的关系，近年来引起业内关注。研究表明，许多临床常用的肿瘤化疗药物均能诱导肿瘤细胞凋亡，凋亡可能是多数化疗药物细胞毒作用的最终共同途径，而参与凋亡过程调控基因的表达失控可能导致肿瘤细胞对多种化疗药物耐受[5]。参与凋亡抑制的基因主要包括bcl2家族、凋亡抑制蛋白家族(inhibition of apoptosis protein，IAP)。本实验通过MTT、流式细胞术检测得出DDP联合NanoFe3O4组对肺癌细胞A549抑制率明显高于相应浓度DDP组，早期肿瘤细胞凋亡率增高，提高了DDP疗效。本实验通过检测凋亡相关基因及耐药蛋白的变化，进一步探索NanoFe3O4联合DDP增敏化疗的机制。

　　bcl2是目前研究最深入也是最重要的细胞凋亡抑制基因之一。Bcl2家族蛋白是一种膜整合蛋白，通过抗氧化、调节胞内Ca2+浓度、调节蛋白跨膜转运以及与信号转运蛋白结合、调控信号通路等机制参与MDR形成。在bcl2过度表达的细胞，化疗药物仍能进入细胞内，诱导细胞损伤，但这种损伤不能有效地转换成凋亡的信号，以致在化疗期间表达bcl2的肿瘤细胞又能以较快的速率重新生长，导致MDR的产生[6]。本实验通过灰度值半定量比较显示，NanoFe3O4联合DDP的C组bcl2 mRNA表达水平明显低于其余3组，且空白组(A组)、DDP组(B组)、DDP联合NanoFe3O4组(C组)bcl2 mRNA表达水平依次递减(除NanoFe3O4组与空白对照组无统计学差异)，差异均具有统计学意义(P&<0.05)。该结果初步说明在A549中，NanoFe3O4可能通过下调bcl2来促进凋亡，从而增敏化疗。

　　survivin是IAP的新成员，具有抑制凋亡和调节细胞增殖的双重作用，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，其编码的蛋白由142个氨基酸组成，相对分子质量约为16 500[7]。survivin组织分布有明显的选择性，除胚胎组织外，在正常成人组织中(除胸腺和生殖腺)不表达，在几乎所有恶性肿瘤组织内均有表达[810]。目前，survivin已经成为非小细胞肺癌最显著的独立预后影响因子之一[11]。而本实验肺腺癌A549细胞表达survivin mRNA，但4组差异不具有统计学意义，作者认为可能与survivin与bcl2抑制细胞的凋亡机制不同有关。bcl2通过干扰细胞色素C自线粒体的释放而阻断caspase蛋白酶连锁反应的激活，而survivin在bcl2的下游直接抑制caspase蛋白酶。此外，国内学者研究A549耐DDP细胞株不管是否用VP16处理，均不表达survivin mRNA，推断survivin并不参与A549/R细胞MDR的产生机制[12]。

　　ERCC1(切除修复交叉互补基因)是核苷酸切除修复系统(nucleotide excision repair，NER)途径的关键基因，其表达产物与着色性干皮病基因F (xeroderma pigmentosum pomplementary group，FXPF)形成异二聚体，ERCC1/XPF具有识别损伤DNA的功能，而且具有5′及3′核酸内切酶的活性，参与了对铂DNA加合物的损伤修复，研究证实其表达升高与多种肿瘤DDP耐药有关[13]。缺失有功能ERCC1的细胞不能修复DDP所致的DNA损伤[14]。ERCC1过表达可使停滞在G2/M期的损伤DNA迅速修复，导致其对DDP耐药。本实验RTPCR测得DDP加NanoFe3O4组的ERCC1 mRNA表达水平低于DDP组，且组间存在统计学差异(P&<0.05)，与既往研究结果一致。

　　MRP属ATP结合转运蛋白超家族成员，又称GSHX泵。通过转运GSX复合物，参与胞质囊泡的运输，从而降低胞内的药物浓度，增加外排产生耐药[15]。MRP介导亲脂性抗癌药物的耐药，过度表达MRP的细胞可通过抗凋亡基因的过度表达与下调前凋亡基因而抵抗化疗药物诱发的凋亡[16]。本实验DDP加NanoFe3O4组MRP的表达量低于其余各组，与bcl2表达趋势一致。国内外研究表明，MRP不仅与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达具有显著正相关性，同时与bcl2表达亦呈显著正相关[17]。本实验与该结论一致，说明耐药蛋白与凋亡相关因子之间存在密切联系。

　　目前利用纳米材料作为药物载体，提高肿瘤细胞胞内化疗药物浓度，逆转耐药、增强化疗敏感度，已成为研究热点[18]。NanoFe3O4是带有正电荷的基团，生理状态下存在，具有安全、制备简单、生物相容性较好的优势，在生物医学领域具有良好应用前景[3]。但其到底通过何种途径增敏化疗，目前尚不清楚。凋亡相关基因与MDR基因之间关系密切，已有学者提出联合检测，可作为筛选铂类方案的指标[19]。本实验通过检测凋亡相关基因及MRP，证实NanoFe3O4联合DDP在一定程度上可下调A549 bcl2、ERCC1及MRP的表达，从而增敏化疗。细胞凋亡相关基因与MDR基因的相关性也为肺癌耐药逆转及基因治疗提供了一个新的研究方向。

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