葛根素抑制葡萄糖腹膜透析液中糖基化终末产物形成的体外研究

　　　　　　 作者：张苗，蒋春明，孙琤，龚立峰

【摘要】 目的： 观察葛根素能否在体外减少葡萄糖腹膜透析液中晚期糖基化终末产物(AGEs)的产生。方法： 将20g牛血清白蛋白充分溶解于1000ml2.5%腹膜透析液中，根据葛根素终浓度分5组观察(葛根素终浓度A组为0 g·L-1，B组为0.01 g·L-1，C组为0.05 g·L-1，D组为0.1　g·L-1，E组为0.2g·L-1)。过滤除菌后37℃保存，分别于第1天、7天、1个月、2个月以及3个月时取样本1ml进行AGEs测定。结果： 腹膜透析液中添加牛血清白蛋白后，随着时间的延长，透析液中AGEs的浓度逐渐升高。加入不同浓度葛根素的试验组，其AGEs的浓度均较同期未加入葛根素的试验组明显降低，并且随着葛根素浓度增加，AGEs的浓度渐降。结论： 葛根素对体外腹膜透析液中AGEs形成有明显的抑制作用，且它的这种抑制作用呈现剂量依赖性。

【关键词】 葛根素;腹膜透析;晚期糖基化终末产物

葡萄糖腹膜透析液(peritoneal dialysis solution，PDS)的生物不相容性已被人们所公认，其是导致腹膜纤维化、腹膜透析功能丧失的主要原因。近年的研究表明，葡萄糖PDS可导致大量晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products，AGEs)的形成，继而AGEs在腹膜纤维化的发生发展中发挥显著作用[1]。近年来，许多实验研究证明，中药葛根素(Puerarin)具有抑制蛋白质非酶糖基化作用，从而减少AGEs形成[2]。本研究探讨了葛根素是否具有抑制葡萄糖PDS产生AGEs的作用，报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与仪器

　　2.5%Baxter PDS为广州百特医疗用品公司产品;葛根素注射液为浙江康恩贝制药股份有限公司产品，规格为100 mg·支-1;牛血清白蛋白购自GIBCO公司、蛋白酶K购自Merck公司;AGEBSA标准品(10mg·ml-1)购自Biovision公司;1050型高效液相色谱仪和1046型荧光检测器为美国Hewlett Packard公司产品。

　　1.2 AGEs测定方法

　　所需检测样本20μl注入高效液相色谱仪，流动相(去离子水)流动速率稳定在0.5ml·min-1，设定荧光检测器激发波长247　nm，发射波长440　nm，每份样本进样2次，2条荧光曲线峰高的平均值用于计算结果。

　　称取40 mg蛋白酶K，用25mlPBS液配置成1.6mg·ml-1蛋白酶K溶液，吸取AGEBSA标准品溶液270 μl和蛋白酶K溶液30 μl混匀，37 ℃孵育24h，得到9mg·ml-1标准AGEP溶液，用PBS液稀释成不同浓度(0.1、0.5、1、5、10、50μg·ml-1)AGEP溶液，同时吸取蛋白酶K溶液20 μl作为空白对照，采用流动注射分析法检测。根据荧光曲线的峰高绘制标准曲线，拟合方程，通过方程计算出样本AGEP含量(U·ml-1)，1 U·ml-1 AGEP相当于1μg·ml-1AGEBSA水解所得的AGEP量。最终结果用μg·ml-1表示。

　　1.3 实验分组

　　将20g牛血清白蛋白充分溶解于2.5%PDS1000ml，根据葛根素终浓度分为A、B、C、D、E5组观察，每组重复6份样本，每份标本样本含量10ml。其中A组葛根素终浓度为0g·L-1，B组为0.01g·L-1，C组为0.05g·L-1，D组为0.1g·L-1，E组为0.2g·L-1。过滤除菌后37℃温箱保存，分别于第1天、7天、1个月、2个月以及3个月时取样本1ml进行AGEs测定。

　　1.4 统计学处理

　　对实验结果中计量数据用x±s表示，组间比较采用方差分析法。

　　2 结 果

　　PDS添加牛血清白蛋白后，随着时间的延长，各组透析液中AGEs浓度逐渐增高，见表1。其中A组增加最多，在第1天为(10.5040±2.64663)μg·ml-1，至第3个月，AGEs浓度就高达(171.2078±38.02560)μg·ml-1。

　　随着添加葛根素的浓度不同，AGEs随时间增加的量也不同。在同一时间点随葛根素浓度升高，AGEs的浓度逐渐降低，见表1和图1。表1 各组AGEs浓度变化与A组比较，1)P&<0.05，2)P&<0.01 图1 葛根素对PDS AGEs形成的抑制作用

　　3 讨 论

　　早期研究显示，尿毒症患者应用葡萄糖PDS进行透析，3个月后即可在腹膜上出现AGEs的沉积[3]。随着透析时间的延长，这种沉积变得更显著、更广泛。当换用非葡萄糖PDS进行透析一段时间后，透出液中AGEs含量可明显下降，提示葡萄糖PDS的应用是AGEs形成的主要原因[4]。进一步的研究发现，传统的葡萄糖PDS在加热消毒过程中产生大量的葡萄糖降解产物，这是PDS导致AGEs形成的主要原因[5]。有人发现大于85%的咪唑啉酮和大于70%的羧甲基赖氨酸主要来源于葡萄糖降解产物，而由于高糖本身导致的AGEs仅占很少一部分，并发现使用非传统的过滤消毒法AGEs产生明显减少[6]。

　　AGEs在其他器官损害中的致病作用已屡见报道。近年来的研究表明，AGEs可以通过直接修饰，或通过其受体或其他结合蛋白的介导在腹膜纤维化机制的多个途径发挥主要作用。Rashid 等[7]将透析患者透出液中分离出来的单核细胞与AGEs修饰的人血清白蛋白在体外一起孵育，结果发现AGEs修饰的人血清白蛋白可刺激单核巨嗜细胞分泌肿瘤坏死因子α、IL1β等，这些都能促进基质合成，引起腹膜形态学改变。AGEs尚能直接刺激腹膜间质细胞释放血管内皮细胞生长因子，促进新生血管的形成，导致腹膜通透性增高、失超滤[8]。通过尿毒症大鼠模型观察发现，尿毒症大鼠腹膜透析后腹膜有AGEs的沉积，它能上调致纤维化因子TGFβ的表达。TGFβ尚可促进间皮细胞向纤维母细胞转分化，从而诱导腹膜纤维化[9]。体外细胞培养的研究也证明，AGEs可加速腹膜间皮细胞凋亡[10]，抑制细胞增殖，使腹膜抗纤维化的屏障间皮细胞层脱落、缺失。

　　中药葛根素是从豆科植物葛[Pueraria lobata (Wild) Ohwi]的根中提取的一种异黄酮成分，主要成分是8D吡喃葡萄糖4，7二羟基异黄酮。我们早先的初步研究显示，通过在PDS中添加葛根素可以有效拮抗PDS诱导的腹膜间皮细胞TGFβ高分泌，以及改善患者腹腔局部和全身的高氧化应激状态[1112]，从而具有潜在的腹膜保护作用。近年来，葛根素被公认具有抑制蛋白质的非酶糖基化作用[2]。有人在葛根素干预人血清白蛋白和大鼠晶状体蛋白的非酶糖基化的研究中发现，葛根素可以显著抑制白蛋白和晶状体蛋白的非酶糖基化作用，抑制率分别可达到66%和74%。在动物实验中发现，葛根素提取物可以抑制组织非酶糖基化作用，从而抑制AGEs的形成[13]。还有作者发现葛根素可以抑制糖尿病大鼠肾脏非酶糖基化[14]。

　　本研究中葡萄糖PDS添加牛血清白蛋白后，随孵育时间延长AGEs浓度逐渐升高，各组升高幅度不同，未加入葛根素的A组，在检测的各时间点升高都是最明显的。加入葛根素后，其AGEs浓度随葛根素浓度增加而降低，呈剂量依赖性。因此，本研究结果提示了葛根素具有抑制葡萄糖PDS形成AGEs的作用，将其作为添加剂应用于腹膜透析是否能在一定程度上防止腹膜纤维化的发生，值得深入研究。

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