结肠癌组织中ADAM9的表达及其与微血管密度的关系

【摘要】 目的： 探讨结肠癌组织中去整合素金属蛋白酶9(ADAM9)的表达及其与微血管密度的相互关系及临床意义。方法： 应用RTPCR方法检测结肠癌组织中ADAM9的表达情况，并与癌旁正常结肠组织进行比较;采用免疫组化二步法(Envision法)检测35例结肠癌组织及癌旁正常组织中ADAM9及CD34蛋白表达。结果： RTPCR结果表明，在结肠癌组织中ADAM9 mRNA的表达水平较癌旁正常组织明显升高。免疫组化显示，ADAM9在结肠癌组中阳性率明显高于癌旁正常组织，具有统计学意义(P&<0.05);浸润深度达浆膜层组ADAM9阳性率明显高于未及浆膜层组(P&<0.05);Ⅰ期组ADAM9阳性率明显低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期组(P&<0.05);ADAM9在结肠癌中的表达与年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、组织学类型和分化程度无关(P&>0.05);结肠癌组平均MVD值高于癌旁正常组(P&<0.05);ADAM9阳性表达组MVD值高于ADAM9阴性组(P&<0.05)。结论： ADAM9与结肠癌的疾病进展及肿瘤血管生成有相关性。

【关键词】 结肠癌; 去整合素金属蛋白酶　9; 微血管密度; 转移

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一[1]，发病率占我国恶性肿瘤的第4位，并有上升趋势。目前普遍认为，结肠癌的发生、发展是一个逐步进展的多因素、多基因参与的多阶段过程。随着分子生物学研究的进展，已有多种基因表达产物被证实与结肠癌的发生发展密切相关，其中包括多种蛋白水解酶类。

　　ADAM9，即去整合素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM 或metalloprotease/disintegrin/cysteinerich，MDC)9，又称meltrin γ。人类和鼠的各种组织均有ADAM9 的表达，人类ADAM9基因定位于人染色体的8p11.23，全长4 447 bp，包含22个外显子。活性ADAM9 的相对分子质量为84 000，和其它ADAM 家族成员一样，含有8个结构域。研究发现ADAM9在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤及其转移癌中的表达都显著增高[2]。本研究旨在探讨ADAM9在结肠癌组织中的表达情况及其与微血管密度(MVD)的关系，并分析其与临床病理特征之间的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源

　　取2007年3～10月东南大学附属中大医院普外科切除结肠癌组织标本及相应病例癌旁正常结肠的新鲜组织标本各5例，冻存于-70 ℃冰箱待提取RNA。免疫组化用石蜡块来源于 2005年12月～2008年9月东南大学附属中大医院普外科手术切除的结肠癌标本35例：男30例，女5例;年龄36～91岁，中位年龄为78岁。其中腺癌13例，管状腺癌17例，黏液腺癌5例;按照AJCC/UICC推荐的TNM分期(2003年)[3]Ⅰ期5例，Ⅱ期10例，Ⅲ期10例，Ⅳ期10例。另取5例癌旁正常组织(距肿瘤组织超过5 cm)。以上病例的病理结果均经东南大学附属中大医院病理科诊断确认。所有病例经辅助检查明确诊断，手术前均未行放、化疗及免疫等抗肿瘤治疗，无二次手术史。组织标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，行4 μm连续切片。

　　1.2 主要试剂

　　RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司)，RTPCR试剂(Fermentas公司)，一抗为兔抗人ADAM9多克隆抗体(CHEMICON公司)，鼠抗人原始造血细胞(CD34)单克隆抗体(北京中杉金桥公司)，Envision system HRP抗鼠/兔免疫组化二抗试剂盒(NHistofine公司)，浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥公司)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 RTPCR

　　(1)总RNA的提取：称取50 mg组织，用玻璃匀浆管在冰浴下快速匀浆，加入1 ml Trizol试剂，按试剂说明书提取细胞内的总RNA;紫外分光光度仪测定RNA样品浓度(A260 nm /A280 nm在1.8～2.0)。(2)引物的设计与合成：在GenBank查到人类ADAM9和βactin(内参)的编码序列，合成引物序列，ADAM9引物设计参阅文献[4]。ADAM9扩增产物的长度为424 bp，ADAM9上游引物5′CCTCGGGGACCCTTCGTGT3′，下游引物5′ATCCCATAACTCGCATTCTCTAAA3′;βactin扩增产物长度为220 bp，βactin上游引物5′GATGGAGGAGGCTCAGCAAG3′，下游引物5′TCGCAATAGGCAAAGATGAGTCC3′。(3)按照两步法RTPCR试剂盒说明书分别进行反转录和PCR扩增，PCR的反应条件：94 ℃ 变性4 min;然后94 ℃ 60 s、48 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s进行35个循环扩增;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μl PCR产物与1 μl上样缓冲液混合后上样于1%琼脂糖凝胶，80 V恒压电泳10～15 min，电泳结果应用Image MASTER凝胶成像仪紫外光下照相。

　　1.3.2 免疫组化法

　　1.3.2.1 制片 蜡块连续切片(4 μm)常规脱蜡水化，柠檬酸组织抗原修复液对切片进行高压抗原修复，一张切片加50 μl兔抗人ADAM9抗体(1∶250)，另一张切片加50 μl鼠抗人原始造血细胞(CD34)单克隆抗体(1∶100)，室温下孵育1 h，加50 μl二抗，室温下孵育10～15 min，加100 μl新鲜配制的DAB显色4 min，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，切片用酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，对切片拍照。

　　1.3.2.2 结果判断[5] (1) ADAM9半定量评分：ADAM9阳性染色信号为棕黄色颗粒，主要位于细胞浆和细胞膜，对棕色反应的阳性强度及阳性细胞率分别进行分级计分，根据两项之和判断结果。每张切片至少选取5个高倍(×400)视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞的染色强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别记为0、1、2、3分，ADAM9阳性细胞率取5次阳性细胞计数平均值，按&<25%、25%～50%、51%～75%、&>75%分别记为0、1、2、3分，然后根据两项记分之和判断其结果，即大于等于2分的记为阳性，小于2分的为阴性。(2) 肿瘤组织内微血管密度(MVD)的计算：参照Weidner等[6]的评判标准，计算肿瘤内着色的毛细血管和微小血管，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群者均作为一个血管计数，但肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数。首先在低倍镜下(×100)全面观察切片，寻找高血管密度区，然后在200倍视野下进行血管计数，每例标本分别计数3个视野，取其平均值。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据均用SPSS 11.5软件包处理，进行统计学分析，定量资料采用t检验和方差分析，定性资料采用χ2检验、Fishier精确概率法、Spearman相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 RTPCR结果

　　如图1所示ADAM9 mRNA在癌组织(C组)中表达量较癌旁正常组织(N组)明显升高，在癌旁正常结肠组织(N组)中ADAM9 mRNA表达低于检测水平。

　　2.2 ADAM 9蛋白在结肠癌及癌旁正常结肠组织中的表达情况

　　ADAM9在人结肠癌组织中主要表达于肿瘤细胞，阳性着色于细胞膜及胞浆中，以胞浆为主，呈棕黄色，弥漫性分布，癌旁正常组织中多数黏膜上皮呈阴性着色，部分胞浆呈弱着色，细胞膜均未有阳性着色(图2)。在结肠癌组织中ADAM 9阳性率为80.0%(28/35)，癌旁正常结肠组织中阳性率为0%(0/5)，差异有统计学意义(P &<0.05)。

　　在浸润深度未达到浆膜组和侵及浆膜组间，ADAM 9的阳性率差异有统计学意义(P&<0.05);在结肠癌TNM分期中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别与Ⅰ期阳性率比较，差异有统计学意义(P&<0.05);ADAM9在各组织分化程度组、是否淋巴结转移组、是否远处转移组、各组织学类型组、各年龄组及性别组之间阳性率也有差异，但差异无统计学意义(P&>0.05)。见表1。

　　2.3 CD34阳性着色情况

　　结肠癌标本的CD34染色切片中，阳性细胞着色部位主要是血管内皮细胞的细胞膜和细胞浆，且细胞膜着色重于胞浆。CD34染色的血管呈条索状或者具有明显的管腔，正常结肠组织中CD34染色的血管比较均匀，形态规则。而结肠癌组织中，CD34染色的血管明显增多，形态不规则(图2)。结肠癌组织中测得的MVD值明显高于癌旁正常结肠组织中的值(13.00±3.54 vs 43.54±12.97， P&<0.05);在结肠癌组织中，MVD值与浸润深度有关，肿瘤浸润深度达浆膜层MVD值明显高于浸润未及浆膜层组(46.34±12.08 vs 30.00±7.80， P&<0.05);淋巴结转移阳性组中MVD值高于无淋巴结转移组(52.50±10.46 vs 36.00±9.76)，差异有统计学意义(P&<0.05);在结肠癌TNM分期Ⅰ～Ⅳ期MVD值分别为25.80±3.96、35.00±1.56、46.30±7.82、58.20±7.86，差异具有统计学意义(P&<0.05);另外，有远处转移组MVD值明显高于无远处转移组(58.20±7.86 vs 37.68±9.48， P&<0.05)。表1 结肠癌组织中ADAM 9表达与临床

　　2.4 ADAM 9的表达与MVD的关系

　　在ADAM9阳性表达组中的MVD值明显高于阴性表达组(46.29±12.48 vs 32.57±8.77， r =0.443，P&<0.05)，差异具有统计学意义。

　　3 讨 论

　　目前对结肠癌的发病机制、早期诊断及治疗等方面的研究均已取得了长足进步，尤其是近年来结肠癌手术、放疗、化疗等综合治疗技术的日臻成熟，患者的无瘤生存率和生活质量有了很大提高，但其五年生存率仍在50%左右，主要原因是肿瘤局部复发和远处转移。

　　恶性肿瘤细胞的转移往往是一个系列发展的过程，即肿瘤细胞脱离原发灶、向周围组织浸润、进入淋巴管及血流，在循环系统中能够存活的癌细胞到达远隔组织器官的实质当中并建立转移灶，继而肿瘤细胞开始生长增殖[7]。在此过程中，细胞外基质(extracellular matrix， ECM)的降解、生长因子的调节和细胞黏附分子的激活这3个部分通过调节组织微环境，在肿瘤的发生、发展、转移中起了非常重要的作用。

　　有研究表明，当一个肿瘤生长的直径超过2 mm时就必须有新生血管长入[8]，血管生成(angiogenesis)是指在原有的血管床上产生新血管的过程，它不仅在胚胎发育、伤口修复、组织再生等生理过程中起重要作用，而且在肿瘤的生长和转移过程中起关键性作用。在实体肿瘤中，新生血管输送营养物质和排泄代谢废物，是肿瘤进展的必须前提条件之一。同时肿瘤血管的存在为肿瘤细胞侵入循环系统、进而实现远处器官转移提供前提条件。

　　新生血管形成的基本过程为：在血管生成刺激因子作用下，随着血管周围ECM的降解，内皮细胞增殖、迁移，新生血管重新管腔化成型[9]。肿瘤细胞在远处转移部位生长过程的关键步骤是对ECM进行降解。ECM包括多种成分，如胶原蛋白Ⅳ、层粘连蛋白、纤维结合蛋白等，此降解过程需要多种酶类参与，如ADAM9。

　　ADAM9对于ECM的作用机制：ADAM9的金属蛋白酶域被弗林蛋白转换酶等识别后，前导肽被水解，暴露催化中心，使无活性的蛋白水解酶前体转变为有活性的蛋白水解酶，可以降解ECM中的一些蛋白，促进肿瘤血管生成，从而为肿瘤细胞的侵袭和转移提供了有力的条件。

　　据报道ADAM9在有淋巴结转移的乳腺癌中表达为高水平的激活型，而且与HER2/neu 蛋白水平有联系[4]。ADAM9 在胰腺癌、胃癌、皮肤黑色素瘤和肝癌中也表达增高。最近一项实验研究应用鼠模型证实，ADAM9通过劈开EGF受体配位子和成纤维细胞因子受体而促成前列腺癌[10]的发生。ADAM9由有活性的基质细胞分泌，在体外实验中其通过黏合α6β4和α2β1整合素诱发结肠癌细胞的侵袭[11]，而且ADAM9通过调节α3β1整合素和生长因子的敏感度增强非小细胞肺癌细胞的黏附和侵袭，以此促进肿瘤细胞的脑转移[12]。因此，ADAM9通过调节生长因子活性及整合素功能在肿瘤发生、侵袭和转移方面的作用非常重要。

　　本研究表明，ADAM9在结肠癌组织中表达高于正常结肠组织，并且ADAM9的表达与肿瘤分期和浸润深度具有相关性，提示ADAM9参与结肠癌的进展。我们同时对肿瘤微血管密度进行了检测，结果发现ADAM9的表达与肿瘤微血管密度相关，表明ADMA9表达水平与肿瘤微血管生成相关。ADMA9的表达与患者的临床病理资料之间的关系结果表明，ADAM9 表达与肿瘤分期及浸润深度相关，在肿瘤的分化程度、是否淋巴结转移、是否远处转移、各组织学类型之间阳性率等方面也有差异，但差异无统计学意义，可能与本研究所涉样本量偏少有关。综上所述，ADAM9与结肠癌的疾病进展相关，并与肿瘤血管生成有相关性。

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