骨髓间充质干细胞移植治疗腰椎间盘退变的研究进展

　　　　　　 作者：樊守刚，王运涛，吴小涛

【关键词】 椎间盘退变； 骨髓间充质干细胞； 组织工程； 文献综述

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)是引起下腰痛的常见病因之一，临床上常见腰椎间盘突出及腰椎滑脱等疾病，严重影响人们的生活质量。当前的治疗大都是保护生物学功能和缓解症状，而不能从病理生理上解除疾病的发病因素，因而常导致原位或邻近椎间盘疾病复发［1］。自提出骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)概念以来，利用其修复组织损害和促进功能恢复作用的治疗方法成为目前医学领域中最引人关注的热点之一。国内外纷纷有细胞培养、小动物实验及大动物实验从多角度论证此方法，但尚未达到临床试验阶段。作者对此领域研究的新进展作一综述。

　　1 BMMSCs移植治疗腰IDD的可行性论证1.1 BMMSCs移植治疗腰IDD的可行性

　　IDD常伴有髓核（NP）细胞和纤维环(AP)细胞的减少，使它们再生是生物治疗IDD的关键，但这两种细胞的细胞数目少，再生及自我更新能力很差，也不适合组织工程研究。Risbud等［2］从5例腰IDD病人的椎间盘中分离细胞进行培养，通过分析细胞的表面标记、蛋白表达及细胞mRNA的合成，发现其中有向NP及AP细胞分化的细胞活动迹象，论证退变椎间盘中有始祖细胞的存在，从而证明干细胞替代治疗IDD的可能性存在。

　　BMMSCs是一群存在于骨髓中的非造血干细胞，它能够分化为类似椎间盘NP细胞的软骨细胞。Richardson等应用转染技术将腺病毒SOX9作为促进BMMSCs转化为NP细胞的转录因子，培养后PCR检测发现细胞表达出NP特征的基因，他们同时用多聚L乳酸支架培养BMMSCs，也发现它能表达分泌Ⅱ型胶原纤维和蛋白聚糖等类似NP细胞周围介质的沉淀物［3］。另一项实验中Richardson等使用水凝胶标准培养基(C/Gp)分别培养NP细胞、AP细胞和BMMSCs 4周，分析他们的基因和蛋白表达谱，结果BMMSCs表达蛋白多糖和胶原数目与关节软骨细胞相比，更像NP细胞。表明BMMSCs可能分化为NP细胞，存在临床治疗IDD的可能性［4］。

　　1.2 BMMSCs移植治疗腰IDD的优越性

　　BMMSCs作为组织工程的种子细胞具有诸多优势：首先，BMMSCs取自骨髓，来源充足，取材相对较容易；其次，BMMSCs体外分离培养操作简单，细胞通过培养可获得大量扩增；再次，BMMSCs免疫原性低，移植引起的排斥反应相对较轻；最后，可作为靶细胞，便于外源基因的转染和表达调控。这些优势使BMMSCs在基因治疗腰IDD中具有较好的应用前景［5］。

　　2 BMMSCs移植治疗腰IDD的体外实验研究

现行对BMMSCs培养方面的研究较多，多集中于BMMSCs与NP等细胞共培养，观察BMMSCs向NP细胞或AP细胞的分化能力及细胞间相互作用。多数体外培养实验支持BMMSCs移植治疗腰IDD是很有潜力的方法。

　　Le Visage等对AP细胞、NP细胞和BMMSCs分别培养，同时对NP细胞和BMMSCs、AP细胞和BMMSCs共培养，通过RTPCR 和Western blot等技术分析基质中蛋白聚糖、DNA和葡萄糖胺聚糖等成分，免疫组化检测Ⅱ型胶原纤维。结果AP细胞和BMMSCs共培养的基质中葡萄糖胺聚糖等成分明显增多，但此结果并 不能证明BMMSCs对NP细胞基质有更新作用［6］。

　　Vadala等用一个双细胞标记系统和流式激活的细胞分型，在数量上分析男性BMMSCs和女性NP细胞共培养后基因表达谱上的改变。同时用荧光原位杂交技术分析相互作用细胞的X和Y染色体，用一个三维培养系统以允许细胞融合的细胞间相互作用。在三维环境中相互作用细胞共培养两周，BMMSCs被诱发出向一种为软骨形成的基因表达谱改变，提示BMMSCs的分化，NP细胞在细胞外基质和软骨形成方面的基因改变印证了BMMSCs对NP细胞的作用。而且，荧光原位杂交技术分析还证明，细胞融合并不是与NP细胞作用中BMMSCs塑型的原因。结论：这项研究澄清了BMMSCs和NP细胞在三维环境中相互作用，排除了细胞融合。这些数据支持未分化的BMMSCs替代治疗IDD疾病［7］。

　　Steck等在转化生长因子β作用下，将分离出的兔BMMSCs和NP细胞分别接触和非接触细胞共培养，应用PCR技术检测BMMSCs Sox9、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原纤维的表达水平，考察其分子表型与椎间盘细胞及软骨细胞、透明软骨细胞的差别，结果接触培养的BMMSCs表现为环形表达，不接触培养的BMMSCs标记基因未见明显表达异常。说明共生长可使BMMSCs成为组织工程学中NP细胞的可靠代替者［8］。

3 BMMSCs移植治疗腰IDD的动物实验

　　 国内鲍军平等在体外纯化扩增兔BMMSCs，并用氧化铁纳米粒子进行标记，于退变手术当时植入手术节段椎间盘内。分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化，免疫组化法测定Ⅱ型胶原的含量变化，用磁共振扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪。结果表明8周内实验组NP蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量明显较模型组高，差异有统计学意义。而在兔模型上BMMSCs的位置和时间有密切关系，在12周以前，干细胞主要位于NP，但在24周后可观察到干细胞向AP区域迁移，并在形态学上表现出更接近于自体AP细胞的特征［9］。

　　Sakai等用自体BMMSCs移植治疗有IDD的兔模型，分别注射至3个腰段的脊柱椎间盘，与未经过手术的IDD兔作对比，连续观察24周，通过X线平扫、T2相磁共振、组织学、免疫组化及对基质相关的基因表达的检测得出结果：注射兔组相对非手术组，退化的椎间盘X线高度恢复91%，磁共振信号强度81%；相对假手术组分别为67%和60%。这些数字表明在兔模型中BMMSCs可有效治疗退化的椎间盘，证明BMMSCs可能是治疗退化椎间盘的一种有效方案［10］。

　　Ho等搓破新西兰白鼠下腰段椎间盘的AP以诱导椎间盘变性，变性进展程度分别从1个月到7个月，并注入BMMSCs，结果，早期组BMMSCs未明显表现出抵抗退化的作用，晚期组虽然椎间盘高度较低，但无明显退化表现，而且局部的黏多糖数量没有减少，说明BMMSCs有抵抗白鼠椎间盘晚期退变能力［11］。

　　Zhang等用兔做实验，将BMMSCs注入退化的椎间盘后，能增加退化椎间盘蛋白聚糖的表达量，他们的数据支持同种异体BMMSCs移植后能存活，并能增加蛋白聚糖表达，支持BMMSCs移植有治疗IDD的潜力［12］。

　　针对BMMSCs应用于治疗IDD的小动物方面的研究较多，结果多支持BMMSCs的治疗潜力，但在大动物实验研究BMMSCs可治疗IDD的实例目前较少。Wang等对猕猴L3L4、L5L6椎间盘摘除术后，随机分组做陶瓷椎间盘、自体髂骨移植融合及BMMSCs陶瓷混合融合等3种替代治疗，3个月后应用X射线、生化测试、组织学分析及组织形态学，分析其融合及更新状况。结果，BMMSCs陶瓷混合融合效果最好［13］。

　　Hiyama等用通过髓核摘除术制作犬腰IDD模型，手术后4周将BMMSCs注入退化的椎间盘，随后12个月进行放射学、组织学、生物化学、免疫组化及RTPCR分析，结果与对照组比较，注射了BMMSCs组犬有效地促进了退化椎间盘的再生，对BMMSCs FACS和RTPCR分析表明，相对未注射前的BMMSCs，它们从基因水平表达FasL，是具有免疫豁免特点的表型，表明BMMSCs移植具有维持椎间盘细胞免疫豁免，防止退化的作用［14］。

4 BMMSCs移植治疗腰IDD的临床实验　　

　　现对BMMSCs的研究还处于临床前研究阶段，尚无BMMSCs有效治疗人体IDD的实验报道。Haufe等［15］前瞻性研究随机的10例椎间盘性下腰痛病人，都经过椎间盘激发试验诊断，在其退变的椎间盘内注射造血干细胞治疗，后随访6～12个月，考察其因此项治疗而腰痛减轻的程度，结果无一例病人获得疼痛缓解，得出造血干细胞治疗法价值不大的结论。但以此不能否定干细胞治疗IDD方面的研究价值。

5 结　　语

　　BMMSCs移植是近几年组织工程学从生物治疗角度提出治疗腰IDD的新方法，有很大的临床应用潜力，现围绕此领域的大量研究已证实其极有可能在将来成为解除IDD疾患的有效方法。

参考文献

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