缺血致新生大鼠脑室周围白质软化和远期神经行为变化

　　　　　　作者：胡燕，蒋犁，张敏，乔立兴

【摘要】 目的：建立新生大鼠脑白质损伤模型，探讨脑白质损伤后少突胶质细胞(OL)凋亡和远期神经行为的变化。方法：5日龄新生大鼠随机分为实验组和对照组，制作缺血性脑白质损伤动物模型；术后不同时间点观察生长发育，HE染色、免疫荧光标记观察脑组织病理形态改变、细胞变化，悬吊试验、旷场试验、拒俘反应测试神经行为学改变。结果：实验组生长发育明显慢于对照组，HE染色脑室周围白质疏松，侧脑室增大，髓鞘磷脂蛋白(MBP)免疫荧光标记实验组阳性细胞数较对照组明显减少(P&<0.05)，神经行为学检测实验组大鼠神经行为能力减退。结论：成功建立5日龄新生大鼠脑白质损伤模型，显示新生大鼠脑白质损伤是以脑白质少突胶质细胞损伤为主的病变。

【关键词】 缺血性脑损伤； 脑室周围白质软化； 少突胶质细胞; 新生大鼠

产科和新生儿重症监护诊疗技术的发展，大大提高了早产儿的存活率，但随之而来的早产儿脑损伤也较为突出。有研究认为，早产儿脑损伤主要在白质，脑室周围白质软化(periventricular leucumalacia，PVL)是早产儿脑损伤的主要形式［1］，高发于胎龄24～32周的早产儿，发生率达26%～60%［2］。PVL可造成脑白质部位少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)前体的受损和丢失，致使脑白质内髓鞘不能形成，导致成活早产儿呈现痉挛性肢体瘫痪、认知障碍以及视听障碍等后遗症［3］。PVL发病机制复杂，还不完全清楚，尚须进一步研究。本研究采用双侧颈总动脉结扎法(bilateral carotidartery occlusion，BCAO)制作5日龄未成熟大鼠缺血性脑损伤模型，观察其脑室周围白质病理变化和远期神经行为改变情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　5日龄新生SD大鼠10窝，共90只，雌雄不拘，体重8.5～11.0 g，由东南大学医学院实验动物中心提供，髓鞘磷脂蛋白（MBP）单克隆抗体由上海元象医疗器械有限公司提供，山羊抗兔IgG由北京中杉生物公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组

　　90只大鼠随机分为实验组(n=48)和对照组(n=42)两组。观察5、7、14、21、28日龄大鼠生长发育情况，对29、30日龄大鼠进行神经行为学检测。

　　1.2.2 模型制作

　　实验组：大鼠乙醚麻醉后取仰卧位于操作台上，消毒颈部皮肤，作颈腹侧正中切口约0.5 cm长，分离皮下组织，找到血管神经束，分离出双侧颈总动脉，用50丝线完全结扎双侧颈总动脉后缝合皮肤，在37 ℃恒温水浴箱内恢复至活动正常后返回母鼠身边饲养。对照组：手术同实验组，分离双侧颈总动脉，但不结扎，缝合皮肤后回笼。手术中及术后1周内对照组大鼠死亡1只，死亡率为2.4%，实验组死亡13只，死亡率27.1%，最终进入结果分析76只。

　　1.2.3 HE染色及免疫荧光检测

　　1.2.3.1 HE染色 实验动物于7、14、21、30日龄(行为学测试后)行心脏灌注后断头取脑，4%多聚甲醛固定24 h，取视交叉水平作石蜡切片(片厚4 μm)，行常规HE染色。

　　1.2.3.2 荧光抗体标记 分别于7、8、14、21日龄灌注取脑，4%多聚甲醛固定，300 g·L-1蔗糖沉底后取不同冠状面作冰冻切片(10 μm)，加入MBP(1∶200) 4 ℃过夜，暗室中加入山羊抗兔IgG (1∶50) 37 ℃孵育30 min，晾干后于倒置荧光显微镜(Olympus，200倍)下观察脑室周围白质部位细胞形态变化。每个标本连续作3张切片进行标记，每张切片选取5个视野（阳性细胞数最多者）计数，并取其平均值统计。

　　1.2.4 神经行为学测定

　　动物于29日龄行悬吊试验测试肢体肌力，旷场试验、拒俘反应检测随意运动和情感行为能力，“Y”臂迷宫试验测定学习能力，30日龄时复测“Y”臂迷宫试验，检测记忆能力，如果学习训练失败，则成绩不列入统计。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS 15.0进行统计学处理，两样本均数比较采用t检验，结果均以x-±s表示，P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

　　2.1 生长变化

　　实验组大鼠术后有皮肤苍白、皮温降低、活动减少、喂养困难、睁眼时间延迟、体重增长缓慢等异常表现。术前两组大鼠体重相差不大，术后实验组体重平均增长幅度低于对照组，第7天至1个月同日龄大鼠处死前体重明显低于对照组(P&<0.05，表1)。实验组和对照组大鼠睁眼时间分别为(16.5±1.29)d和(13.5±0.82)d，两组差异有统计学意义(t=3.589，P&<0.05)。见表1。

　　2.2 HE染色

　　7日龄各组大鼠大脑外观未见明显改变，实验组大鼠镜下可见脑白质部位细胞水肿，细胞周围间隙增宽，脑室周围白质内大量OL呈凋亡样变化：胞浆浓缩，核质凝集，形成蓝黑色凋亡小体，个别区域有小片的坏死区，部分神经细胞胞核碎裂溶解消失，表现为坏死。但皮质、海马等部位细胞结构基本完整，未见明显的病理改变。14、21、30日龄实验组大鼠脑室周围白质较对照组明显染色浅且疏松，脑室周围白质及内囊组织相对疏松，内囊有空腔形成，脑室进行性扩大。对照组大鼠同时间点未见以上病理变化。见图1。表1 两组大鼠不同日龄体重比较

　　2.3 免疫荧光标记

　　荧光显微镜下可见MBP标记的细胞呈黄绿色荧光(图2)。7日龄实验组术后可见阳性细胞数目较对照组减少，8日龄减少最为明显，与对照组相比，差异有统计学意义(P&<0.05)，14、21日龄两组阳性细胞数差异无统计学意义(P&>0.05，表2）。

　　2.4 神经行为学测定

　　29日龄实验组大鼠在悬吊试验中悬吊在玻璃棒上时间较对照组短，在旷场试验中活动及后肢站立次数较对照组少，拒俘反应试验中表现为较易捕获，试验评分均较对照组低(P&<0.05)。“Y”臂迷宫试验显示对照组大鼠经一定训练次数(32.6±8.2)d后可学会逃避电击，24 h后记忆保持率为(81.28±10.3)%，而实验组大鼠在同等训练次数后无法学会逃避电击，表现为感觉障碍，对电流不敏感，运动能力迟缓，无逃避行为，故24 h后未进行记忆保持率测试。见表3。表2 两组大鼠不同日龄MBP标记细胞数目比较 表3 两组大鼠行为学比较

　　3 讨　　论

　　PVL是指侧脑室周围白质的坏死，常在大脑半球的白质区形成囊腔。未成熟脑白质主要由OL前体细胞构成，导致脑白质损伤的关键是OL损伤，OL是中枢神经系统的成髓鞘胶质细胞，其损伤主要影响髓磷脂的产生，最终导致脑白质的缺损，脑白质容积减少，脑室扩张等［4］。缺血在PVL发病机制的学说中占了主导地位，未成熟脑血流调控机制不成熟、脑白质在发育期血供不足和OL的前体细胞对损伤有高度的敏感性是PVL主要发病因素，血流降低会导致脑室周围白质中的OL损伤、凋亡、坏死，数量减少，从而致使髓鞘合成障碍，引起远期的神经行为缺陷。

　　研究表明，7日龄大鼠神经系统发育相当于人类足月或近足月的新生儿，脑组织中OL已逐渐发育成熟并发生髓鞘化，该阶段的OL对损伤易感性不强。大鼠生后5 d是神经元迁移的终末阶段，Uehara等［5］采用5日龄Wistar大鼠双极电凝器切断双侧颈动脉，2 d后检查，90.9％的大鼠内囊及周围白质出现病变，包括凝固性坏死和囊性变，54.5％皮质下白质受累而仅有22％皮质受损。张龙等［6］利用5日龄新生SD大鼠脑内注射神经毒素3硝基丙酸成功建立了PVL模型。Cai等［7］利用BCAO后联合低氧建立4日龄SD大鼠脑损伤模型。研究证实，鼠类生后5 d相当于人类妊娠24～30周［8］，1～5 日龄大鼠脑白质以OL的前体细胞为主，容易受损，从而影响髓鞘的形成，最终导致脑白质的缺损［9］。故本实验选择5日龄的SD大鼠通过BCAO模拟PVL病变。

　　本实验显示，缺血增加大鼠的死亡率，相同日龄实验组幼鼠体重明显低于对照组，并且睁眼时间延迟，大鼠的生长发育延缓。PVL的病理特征是白质出现明显损伤，而皮质损伤轻微，本实验模型主要表现为早期脑白质部位细胞水肿，细胞周围间隙增宽，脑室周围白质内OL凋亡坏死增多，皮质下及脑室周围白质出现疏松及液化灶，后期形成囊腔和脑室扩大，而脑皮质无明显变化。本实验MBP免疫荧光标记显示，缺血性脑损伤后MBP标记的细胞减少。MBP是反映OL及髓鞘结构、功能的重要指标之一，实验组早期免疫荧光MBP抗体标记阳性细胞数减少较对照组明显，生后2周对照组MBP阳性细胞数开始减少，系大鼠OL已发育成熟，MBP表达量减少。研究证实，在早产儿PVL的好发期，晚期OL前体更易受到缺氧缺血等因素的影响，导致白质内髓鞘不能形成，临床上呈现脑瘫和智能落后等后遗症［10］。PVL患儿神经行为学障碍在幼儿期才明显固定化，通常认为大鼠1月龄约等同于人类的2～5岁，其神经行为学特征性表现已经能够充分展示［11］，因此对29、30日龄大鼠进行神经行为学检测结果较为可靠。本实验表明，BCAO实验组动物与对照组比较有明显的远期神经行为学异常，表现为随意运动受限，肌力减弱，情感行为及学习能力差，且有明显的感知障碍，实验组神经行为表现与病理改变一致。

　　本研究显示，5日龄新生大鼠因双侧颈总动脉结扎缺血引起脑室周围白质严重损伤，出现液化、脑室扩大，OL凋亡较对照组增多，术后出现生长迟缓和远期神经行为功能缺陷，因此，有助于理解早产儿脑白质损伤发病机制和神经病理学变化，为PVL病理学机制及干预提供理论基础。

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