MRL/lpr小鼠肾组织MCPl表达及MMF对其表达的影响和相关机制研究

【摘要】 目的：检测MRL/lpr狼疮小鼠肾组织单核细胞趋化蛋白1（MCP1）表达及探讨霉酚酸酯（MMF）对其影响和相关机制，研究MMF对MRL/lpr狼疮小鼠的治疗作用。方法：MRL/lpr狼疮小鼠分为对照组和治疗组两组。观察肾组织病理学改变及其MCP1、CD14和蛋白激酶C（PKC）等的表达以及尿蛋白、抗dsDNA抗体水平的变化。结果：对照组小鼠肾小球基底膜增厚，系膜基质增多，肾组织MCP1表达上调，CD14+细胞数明显增多，伴尿蛋白及抗dsDNA抗体水平增加。治疗组小鼠肾组织MCP1表达减少，CD14+细胞数减少，尿蛋白和抗dsDNA抗体水平减少，且肾小球MCP1与其PKC表达水平及肾小球CD14+细胞数、尿蛋白水平呈直线相关关系。结论：MMF对MRL/lpr小鼠自发狼疮肾炎具有治疗作用，其机制可能通过抑制PKC通道激活减少小鼠肾组织MCP1的表达，从而减少肾组织单核细胞的浸润，减轻肾脏损害。

【关键词】 单核细胞趋化蛋白1； 狼疮肾炎； 霉酚酸酯； 蛋白激酶C； 小鼠

近来研究发现单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein1，MCP1)是一种特异性的单核细胞趋化因子，能活化单核细胞并趋化其在肾脏聚积，还可以通过上调某些β2整合素的表达，使单核细胞的黏附增强，参与肾脏的损害［1］。国内研究发现狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)患者肾小球内MCP1表达与尿蛋白水平及单核细胞浸润的数量相关［2］，我们已报道LN患者尿MCP1水平与疾病的活动性明显相关［3］。

　　免疫抑制剂霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)抑制嘌呤合成的起始途径，选择性地抑制T、B淋巴细胞增生，初步临床研究［2］证明，MMF对难治性Ⅳ型LN患者具有满意的疗效，可使患者肾功能改善，蛋白尿、血尿明显减少，体液免疫亢进得到抑制，肾脏活动性病变减轻。但MMF是否通过下调肾组织MCP1表达而发挥其肾脏保护作用尚不清楚。本实验利用MRL/lpr自发狼疮小鼠探讨了MCP1产生的相关机制，并观察了MMF对LN肾组织MCP1表达的影响及对狼疮小鼠的治疗作用。

1 材料和方法

　　1.1 实验材料

　　MRL/lpr小鼠(12只，雌性，3月龄，购自中国科学院上海实验动物中心)，羊抗小鼠MCP1多克隆抗体(由美国俄亥俄州立大学医学和卫生学院Rovin教授惠赠)，羊抗小鼠CD14多克隆抗体(邦定泰克，抗单核/巨噬细胞)，羊抗小鼠蛋白激酶C（PKC）多克隆抗体(武汉博士德公司，浓缩型)，MMF胶囊(上海罗氏公司惠赠)。

　　1.2 实验动物分组

　　MRL/lpr小鼠体重20～30 g，随机分成对照组和治疗组两组，每组6只，饲以普通饲料。其中对照组予MMF同体积的0．5％羧甲基纤维素水灌胃；治疗组予含MMF(90 mg·kg-1·d-1)的0．5％羧甲基纤维素水灌胃，治疗3个月。于实验前及结束时取眶后静脉血，留取血清冻存备测，每两周留取24 h尿蛋白量备测，实验结束时处死动物，肾脏予冰生理盐水灌洗后分别予甲醛、戊二醛固定待测。

　　1.3 尿蛋白测定

　　采用考马斯亮蓝法测定其蛋白含量。

　　1.4 血清抗dsDNA抗体的测定

　　采用ELISA法测定血清抗dsDNA抗体。主要步骤如下：96孔酶标板每孔加入100 μl dsDNA抗原包被液进行包被，后予1％牛血清白蛋白封闭24 h，依次加入按1∶50稀释的小鼠血清，1∶1 000稀释的羊抗小鼠IgGHRP，每次均37 ℃孵育1 h，用OPD底物显色液显色，分光光度计检测其A492 nm值。

　　1.5 肾组织常规病理学分析

　　甲醛固定的肾组织，经石蜡包埋，4 μm厚切片，分别进行HE和PAS染色。肾组织病理定量分析：（1）HE染色片，随机选取5个肾小球，计算每个肾小球中细胞个数。（2）肾小球系膜基质增生半定量分析，采用北京航空航天大学计算机医学病理图像分析系统肾小球分析模块，取PAS染色切片，每张切片观察5个正切肾小球，计数肾小球系膜区面积占整个肾小球面积的百分比。（3）肾小管间质半定量分析，取PAS染色切片，每张切片观察5个不含肾小球的皮质视野，计数肾间质面积占整个视野的百分比。

　　1.6 肾组织MCP1、CD14及PKC免疫组化检查

　　石蜡切片常规脱蜡至水，3％h302封闭，微波修复抗原5 min×2次，间隔5～10 min，蒸馏水漂洗，正常山羊血清室温封闭20 min；加入Ⅰ抗(羊抗小鼠MCP1、CD14及PKC多克隆抗体)，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗，加入Ⅱ抗(辣根过氧化酶标记的兔抗羊IgG)，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗；加入DAB室温显色10 min，蒸馏水漂洗；1％盐酸乙醇分化20 s，脱水、透明、封片，显微镜观察。

　　1.7 MCP1、PKC及CD14+表达的定量分析

　　（1）肾小球中MCP1表达：每张切片随机选取5个肾小球，计算每个肾小球内抗体染色阳性细胞数，以均值表示每例肾小球中阳性细胞数。（2）皮质区肾小管中MCP1、PKC的表达：在10个高倍视野下计算每张切片皮质区阳性小管所占的百分率，以平均值表示。（3）CD14+的定量分析：每个标本按顺序选取3个肾小球视野、3个肾间质视野，选用彩色系统定标，以直径大于4 μm的目标作为CD14+细胞，计数每个肾小球及单位面积肾间质CD14+细胞数(即单核巨噬细胞数)。（4）肾小球中PKC的表达：每张切片随机选取10个肾小球，计算每个肾小球中阳性染色区域面积占整个肾小球面积的百分比，以均值表示。

　　1.8 数据处理

　　计量资料用x-±s表示，两组资料比较采用t检验；多组资料比较采用单因素方差分析；肾组织MCP1的表达与尿蛋白水平、肾小球单核细胞数及PKC水平关系用直线相关回归分析。

2 结　　果

　　2.1 MMF对MRL/lpr小鼠24 h尿蛋白定量的影响

　　对照组小鼠从实验第2周始，尿蛋白量逐渐升高，至第12周时高达8．6 mg·（24 h）-1，除第2周外，各时间点与实验开始前相比，差异有统计学意义(P&<0．01)。治疗组小鼠在治疗的初期尿蛋白量也逐渐上升，至治疗8周后尿蛋白量开始下降，于治疗的第12周时达到最低值，6、8、10和12周时治疗组与对照组比较，差异有统计学意义(P&<0.05或P&<0．01)，除第8、10周外，治疗组各时间点与实验开始前比较，差异无统计学意义(P&>0．05)。见表1。表1 MRL/lpr小鼠24 h尿蛋白含量 与同时间对照组比较，1）P&<0.05，2）P&<0.01

　　2．2 MMF对MRL/lpr小鼠血清抗dsDNA抗体水平的影响　　实验结束时，治疗组血清抗dsDNA抗体水平明显下降，与对照组相比，差异有统计学意义(P&<0.05)；对照组和治疗组实验前差异无统计学意义(P&>0．05)。见表2。

　　2．3 MMF对MRL/lpr小鼠肾组织病理变化的影响

　　常规病理学检查显示，对照组小鼠光镜下肾小球基底膜（GBM）明显增厚、弯曲，肾小球系膜细胞增生、基质增生；PAS染色可见GBM弥漫性增厚，系膜基质区增宽，部分呈双轨征。治疗组病理改变较轻。见表3。

　　2．4 MMF对MRL/lpr小鼠肾组织MCP1表达的影响　　对照组肾组织MCP1表达上调，主要见于肾小球系膜细胞、球囊壁层上皮细胞以及新月体形成的部位，在肾小管间质则主要见于肾小管损伤的部位；应用MMF干预后，小鼠肾小球及肾小管中MCP1表达受到抑制，肾小球和肾小管MCP1阳性细胞数减少，与对照组相比，差异有统计学意义。见表4，图1、2。表2 MRL/lpr小鼠血清抗dsDNA抗体水平(OD值)与同时间对照组比较，1） P&>0.05；2） P&<0.05表3 MMF对肾组织病理的影响与对照组比较，1） P&<0.01，2） P&<0.05 表4 MRL/lpr小鼠肾组织MCP1的表达

　　2．5 MMF对MRL/lpr小鼠肾组织CD14+细胞(单核细胞)数目的影响　　MMF治疗后，MRL/lpr小鼠肾小球内浸润的CD14+细胞(单核细胞)数目较对照组明显减少，差异有统计学意义，但肾间质单核细胞数与对照组相比无明显变化(P&>0．05)。见表5。表5 MRL/lpr小鼠肾组织CD14+细胞数目的变化 与对照组比较，1） P&<0．01，2） P&>0．05

　　2.6 MRL/lpr小鼠肾小球中MCP1表达与尿蛋白含量及单核细胞数之间的关系　　MRL/lpr小鼠肾小球中MCP1表达与尿蛋白含量呈显著正相关，相关系数r=0.726 02，回归方程为y=3.304 75+0.194 11x，决定系数R2=0.527 1(F=15.60，P&<0.01)；肾小球中MCP1表达与单核细胞数呈显著正相关，相关系数r=0.557 93，回归方程为y=-1．318 18+0．272 73x，决定系数R2=0.311 3(F=8.14，P&<0.05)；肾小管间质MCP1表达与间质单核细胞数无相关性(r=-0.100 06，P&>0.05)。

　　2．7 MMF对MRL/lpr小鼠肾组织PKC表达的影响

　　对照组小鼠肾小球和近端肾小管PKC阳性染色细胞增多，与治疗组相比，差异有统计学意义(P&<0．01)。见表6，图3、4。MCP1的表达与PKC的表达呈显著正相关，相关系数r=0．687 51，回归方程为y=5．399 45+0．711 37x，决定系数R2=0．472 7(F=12．55，P=0．003 2)。表6 MRL/lpr小鼠肾组织PKC表达的变化

3 讨　　论

　　MCP1是一种对单核细胞有强烈趋化作用的细胞因子，文献研究表明慢性肾炎中MCP1表达常有升高，但其在肾组织表达的部位尚有很多争议。作者通过免疫组化研究表明，在发生LN时肾脏中MCP1表达增加，且MRL/lpr小鼠MCP1染色阳性的细胞主要是在肾小球和肾小管间质。Shimizu等［4］在自发狼疮小鼠模型中发现，肾组织中MCP1的表达上调，并且予抗MCP1的基因治疗能减少蛋白尿的程度和减轻肾小球硬化。MRL/lpr小鼠敲除MCP1基因后，尿蛋白和肾脏局部炎症细胞释放的细胞因子减少，小鼠生存期延长，提示肾局部产生的MCP1在肾脏病变中起重要作用，其机制可能与MCP1趋化单核巨噬细胞有关。CD14是单核巨噬细胞表面特异的脂多糖受体，CD68是单核巨噬细胞胞浆内的一种糖蛋白，可作为单核巨噬细胞的标志。由于CD14和CD68阳性细胞分布一致，因此研究中常用肾组织CD14阳性染色细胞数代表单核巨噬细胞数。本研究结果发现，肾组织中MCP1的表达与蛋白尿的程度及单核细胞数(CD14+细胞)呈正相关。推测在LN中，MCP1通过其独特的趋化活性，导致单核细胞、淋巴细胞等炎症细胞在肾脏聚集，并使肾脏局部的单核细胞激活，释放活性氧、活性氮及蛋白酶等，分泌TGFβ等纤维化的细胞因子促进肾间质纤维化和肾小球硬化，最终造成肾功能衰竭。

　　本实验发现对照组小鼠肾组织PKC活性上调，抗dsDNA抗体滴度升高，活动性指数增高。治疗组PKC表达明显下调，而且与MCP1的下调呈直线相关，推测MMF可能通过PKC途径降低肾组织局部的MCP1水平，从而达到抑制局部炎症反应、减轻肾损伤的作用。

　　最近体外研究证实，MPA除作用于免疫细胞外，还可抑制血管平滑肌细胞及血管内皮细胞、肾小球系膜细胞、纤维母细胞的生长。本研究观察到治疗组小鼠单核细胞数明显减少(P&<0．01)，血清中抗dsDNA抗体水平降低，其可能机理是MMF通过抑制T、B淋巴细胞内鸟嘌呤核苷酸的生物合成，耗竭细胞内的GTP储备，从而特异性地阻断T、B淋巴细胞的分裂增殖以及自身抗体的形成，减少免疫复合物沉积引起的病理损害。

　　在本实验中，MMF作为免疫抑制剂于用药第8周后，小鼠尿蛋白开始下降，与对照组相比，差异有统计学意义(P&<0．05)。MMF可能通过抑制系膜细胞增殖及减少免疫复合物在肾小球的沉积，维持肾小球滤过膜的正常通透性，从而减少蛋白尿，并减轻蛋白尿本身的内源性毒性作用给肾脏带来的损害，有助于对长期慢性刺激引起的肾纤维化的防治。有报道［5］尿蛋白在肾小管上皮细胞的过度穿梭对淋巴细胞趋化和纤维化有诱导作用，应用MMF后，它可通过抑制淋巴细胞GTP的合成来减少淋巴细胞的浸润和增殖。此外，尿蛋白减少可能也有助于减少淋巴细胞的浸润，从而减轻肾脏病变。

　　本实验结果发现，与对照组相比，MMF可以明显降低MRL/lpr小鼠肾组织MCPl表达的水平，减轻病变局部炎症细胞的浸润及聚集，病理改变明显减轻，进一步从肾组织病理改变方面证实MMF对肾小球活动性病变有独特的疗效。我们在实验中发现MRL/lpr小鼠肾组织MCPl表达明显上调，与单核细胞数、尿蛋白含量呈正相关，这与Rovin等［6］在人类LN病变中的报道一致，说明肾小球内单核细胞的浸润可能部分受MCP1趋化作用的影响，而且尿蛋白可能是刺激肾小球MCP1表达的因素之一。本研究表明，MRL/lpr小鼠尿蛋白含量与肾小球内MCP1高表达有关，可能间接调控单核细胞浸润，参与肾脏损害。

　　综上所述，MRL/lpr狼疮小鼠肾组织MCP1表达上调，MMF可抑制其肾组织MCP1表达上调，减轻肾脏损害，这可能是通过PKC通路发挥其肾脏保护作用。

参考文献

［1］GIUNTI S，PINACH S，ARNALDI L，et al．The MCP1/CCR2 system has direct proinflammatory effects in human mesangial cells［J］．Kidney Int，2006，69(5)：856863.

［2］丁磊，赵明辉，邹万忠，等．霉酚酸酯联合激素对弥漫增生性狼疮肾炎活动性及慢性病变的影响及其机制研究［J］．中华肾脏病杂志，2002，18(1)：913.

［3］肖刚，甘华，杜晓刚．狼疮肾炎患者血尿MCP1测定的意义［J］．东南大学学报:医学版，2004，23(6)：409411.

［4］SHIMIZU S，NAKASHIMA H，KARUBE K，et al．Monocyte chemoattractant protein1 activates a regional Th1 immunoresponse in nephritis of MRL/lpr mice［J］．Clin Exp Rheumatol，2005，23(2)：239242.

［5］FUJII S，ZHANG L，KOSAKA H.Albuminuria，expression of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and monocyte chemoattractant protein1 in the renal tubules of hypertensive Dahl saltsensitive rats［J］．Hypertens Res，2007，30(10)：991998.

［6］ROVIN B H，DOE N，TAN L C．Monocyte chemoattractant protein1 in patients with glomerular disease［J］．Am J Kidney Dis，1996，27：640646.