超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的影响

　　　　 作者：范国峰，冯毅，童嘉毅，杨芳，马根山，姚玉宇

【摘要】 目的：体外探讨超声联合微泡对内皮祖细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，为进一步体内研究提供科学依据。方法：体外提取、分离和培养猪骨髓内皮祖细胞，随机分为对照组、超声组、超声微泡组，干预后24 h分别采用CCK8检测细胞增殖活性，PI染色流式细胞仪分析细胞凋亡坏死及细胞周期。结果：（1）低声强超声（0.25～1.0 W·cm-2）联合微泡作用下对内皮祖细胞增殖活性无明显影响；较高声强（﹥1.0 W·cm-2）作用下，随声强逐渐增大，细胞增殖活性逐渐降低。（2）与对照组比较，超声微泡组（频率1 MHz，输出功率1.0 W·cm-2，辐照90 s）对内皮祖细胞凋亡坏死及细胞周期无明显影响，而同样条件下超声组细胞凋亡坏死明显增加，同时显著抑制细胞DNA合成。结论：1.0 W·cm-2超声联合微泡干预内皮祖细胞对细胞增殖活性、凋亡坏死及细胞周期无明显不良影响，为进一步应用超声微泡体内干预内皮祖细胞移植的研究提供可能。

【关键词】 超声; 微泡； 内皮祖细胞； 增殖； 凋亡； 细胞周期

药物治疗和血运重建技术的不断发展，使急性心肌梗死的病死率明显降低，但对心肌梗死后心力衰竭仍无有效的治疗手段。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一类能够自我增殖和分化为内皮细胞的干细胞，能促进缺血组织血管新生，增加血流灌注，改善心功能。而超声联合微泡作用能促进组织局部动脉生成，使灌注血流增加；并且在毛细血管壁产生微孔，可能有利于细胞的靶向传输。本实验在体外探讨超声联合微泡对EPCs增殖活性、凋亡坏死及细胞周期的影响，为进一步体内研究超声联合微泡增效EPCs治疗缺血性心脏病提供依据。

1 材料和方法

　　1．1 主要试剂和设备

　　淋巴细胞分离液FicollPaque（天津灏洋生物公司）、培养液EGM2（Cambrex公司）、纤维连接蛋白（Fn，Chemicon公司）；DiI标记乙酰化低密度脂蛋白（DiIacLDL，Molecular Probe公司）、FITC标记荆豆凝集素I（FITCUEAI，Sigma公司）；CCK8试剂盒（碧云天生物科技研究所）、PI凋亡试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；含氟碳气体脂质体微泡（东南大学生物工程材料国家重点实验室）、荧光正立显微镜（Nicon公司）、CZT3超声同步治疗仪（沈阳新乐康复医疗仪器厂）、BioRad酶标仪、FACS Calibur流式细胞仪。

　　1.2 细胞分离、培养和鉴定

　　于雄性中国小型猪胫骨近端抽取骨髓约20 ml，加入FicollPaque分离液，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，以3×105的密度接种于铺有Fn的培养瓶中，培养液用EGM2。培养至7 d左右行DilacLDL和FITCUEAI双染色，记数双阳性细胞为EPCs。

　　1.3 EPCs的干预

　　培养细胞分为对照组、超声组和超声微泡组3组。实验前将培养的EPCs用胰酶消化制成单细胞悬液，摇匀后以100 μl（约5×105 ml-1）加入96孔培养板。对照组不做干预，超声组以频率1 MHz、输出功率1.0 W·cm-2持续辐照90 s；超声微泡组加入5 μl微泡（约2×108 ml-1），以同样超声条件作用90 s。96孔培养板固定在37 ℃双蒸水水槽表面，超声探头垂直置于培养板下方约8 cm处，为避免超声波对邻近孔细胞的影响，隔孔接种细胞，每组8孔。1.4 CCK8测定细胞增殖活性

　　当孔内细胞生长至60%～70%融合时，无血清培养24 h，以0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 W·cm-2的不同声强超声联合微泡干预EPCs，继续培养24 h后每孔加入CCK8溶液10 μl，37 ℃孵育1～2 h，酶标仪上以450 nm测吸光度，细胞增殖越多、越快，则颜色越深，呈线性关系。

　　1.5 流式细胞仪检测坏死凋亡细胞及细胞周期

　　各组细胞干预后继续培养24 h，收集细胞用1 ml冷PBS制成1×105 ml-1的细胞悬液，1 000 r·min-1离心10 min，弃上清，将细胞重悬于200 μl结合缓冲液中，加入PI液5 μl，混匀避光室温反应15 min，再加入300 μl结合缓冲液，流式细胞仪以激发波长488 nm检测，结果输入计算机，直接给出凋亡及坏死细胞百分比，同时获得DNA含量分布结果。

　　1.6 统计学处理

　　采用SPSS 14.0统计软件包进行数据分析，所有数据用x-±s表示，组间比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA），组间两两比较采用Student Newman Keuls（SNK）检验，P&<0.05表示差异有统计学意义。

2 结　　果

　　2．1 EPCs的鉴定结果

　　培养第7天贴壁细胞形态以梭形为主，可见圆形及不规则形细胞。荧光显微镜下，细胞摄取DiIacLDL后呈红色，FITCUEAI染色后呈绿色，双染色细胞中EPCs占90％以上（图1）。

　　2．2 超声联合微泡作用对EPCs增殖活性的影响

　　0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0 W·cm-2不同声强超声微泡组的吸光度值分别为1.344±0.177、1.305±0.159、1.301±0.110、1.234±0.101、1.063±0.093和0.759±0.078（图2）。与对照组（1.325±0.143）相比，0.25、0.5、0.75和1.0 W·cm-2组对EPCs增殖活性无影响（P=0.840），1.5和2.0 W·cm-2组EPCs增殖活性明显下降（P﹤0.05）。可见超声联合微泡作用对EPCs增殖活性无影响的最大超声能量是1.0 W·cm-2，可以在获得最大生物效应同时安全用于实验研究。图2 不同声强超声联合微泡作用下的吸光度（CCK8法）

　　2.3 超声联合微泡对EPCs凋亡坏死的影响

　　为了进一步研究1.0 W·cm-2声强超声联合微泡对EPCs的影响，用PI染色流式细胞仪分析细胞凋亡坏死情况。检测结果显示对照组为(11.84±0.30)%、超声组为(14.70±0.35)%，两组相比有统计学差异（P&<0.05）；超声微泡组为（12.70±0.24）％，与对照组相比无统计学差异（P=0.960）。

　　2.4 超声联合微泡对EPCs细胞周期的影响

　　用流式细胞仪进行细胞周期分析表明，1.0 W·cm-2声强超声作用下处于S期的EPCs比例为（5.11±0.86）％，较对照组（25.20±2.47）％明显减少，有显著统计学差异（P&<0.01）；而超声微泡组为（27.32±5.26）％，较对照组反而有轻度增加，但无统计学差异（P=0.760）。见表1。 表1 对照组、超声组与超声微泡组不同细胞周期EPCs

3 讨　　论

　　缺血性心脏病已成为不同收入国家人口死亡的首要原因，分别占到低中收入和高收入国家患病人口的11.8％和17.3％［1］。而干细胞移植以替代、修复或改善受损心肌组织的生物学功能，显示出良好的临床应用前景，但仍存在移植效率低、心功能改善不肯定等问题［2］。超声微泡作为超声增强造影剂，除用于临床诊断外，目前已用于治疗相关研究。已有实验证实超声介导毛细血管内微泡破裂可促进正常或缺血大鼠后肢局部动脉生成，灌注血流增加，踏车时间延长［35］；同时内皮细胞渗透性及细胞间隙增加，有利于基因、药物和细胞靶向渗入组织［6］。因此我们假设超声破坏微泡联合冠脉内移植EPCs治疗心肌梗死，能够促进心肌内归巢，增强血管生成，增加局部血流灌注，从而进一步改善心功能。本实验在体外研究超声联合微泡增效EPCs治疗的可行性和安全性。实验结果提示，低声强（0.25～1.0 W·cm-2）超声作用下微泡对EPCs增殖活性无影响；高声强（﹥1.0 W·cm-2）作用下，随声强逐渐增大，EPCs增殖活性逐渐降低。为了在体内实验中获得最大生物学效应，如促血管生成、增加血管壁通透性等，我们选择1.0 W·cm-2声强作为超声实验值，进一步研究其对EPCs凋亡坏死及细胞周期的影响。结果表明:与对照组比较，超声联合微泡对EPCs凋亡坏死及细胞周期无明显影响，相反超声组明显增加EPCs凋亡坏死，同时显著抑制EPCs的DNA合成。

　　值得注意的是，1.0 W·cm-2单纯超声抑制EPCs增殖，增加细胞凋亡和坏死，而联合微泡作用时对其没有明显影响。这与超声干预肿瘤细胞的结果基本一致：Feril等［7］应用频率1 MHz的超声(0.5、1.0 W· cm-2)辐照U937肿瘤细胞，持续10 min，观察到两组细胞凋亡都增加。目前认为，上述作用可能与超声的机械作用、热效应和空化效应有关。低强度超声被组织吸收后产生少量热能，增强酶的活性，促进细胞代谢。而较高剂量超声使组织细胞过热导致酶活性破坏，抑制细胞代谢。此外，较高强度超声通过瞬间空化效应使细胞膜、DNA和其他细胞结构损伤，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。当有微泡造影剂存在的时候，超声作用下振动微泡附近可产生剪切力，对邻近细胞发挥生物学效应［8］。已有实验表明，剪切力作用下促进EPCs增殖、分化，eNOS mRNA表达和NO生成增加，同时增强Cu/Zn SOD活性［911］。以上作用可能部分消除单纯超声对EPCs的不良作用，但详细机制还需进一步的实验证实。

　　综上所述，1.0 W·cm-2声强的超声联合微泡作用在获得最大生物效应的同时，对EPCs的增殖活性、细胞凋亡坏死及细胞周期无明显不良影响，为进一步体内研究超声联合微泡增效EPCs移植的可行性和安全性提供了依据，从而使超声微泡辅助的干细胞移植有可能从改善移植细胞归巢入手，成为治疗缺血性心脏病一种新的有效方法。

参考文献

［1］ALAN D L，COLIIN D M，MAJID E，et al.Global and regional burden of disease and risk factors，2001:systematic analysis of population health data［J］.Lancet，2006，367:17471757.

［2］VINCENT F M S，RICHARD T L.Stemcell therapy for cardiac disease［J］.Nature，2008，451:937942.

［3］JI S，MING Q，SANJIV K，et al.Stimulation of arteriogenesis in skeletal muscle by microbubble destruction with ultrasound［J］.Circulation，2002，106:15501555.

［4］SONG J I，PATRICK S C，ALEXANDER L，et al.Microvascular remodeling and accelerated hyperemia blood flow restoration in arterially occluded skeletal muscle exposed to ultrasonic microbubble destruction［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287(6):h37542761.

［5］JUNJI Y，KOJI O，HIROTO T，et al.Treatment of ischemic limbs based on local recruitment of vascular endothelial growth factorproducing inflammatory cells with ultrasonic microbubble destruction［J］.J Am Coll Cardiol，2005，46:899905.

［6］SOPHIE H，ALEXANDER L，KLIBANOV S.Microbubbles in ultrasoundtriggered drug and gene delivery［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2008，60:11531166.

［7］FERIL L B，KONDO T，ZHAO Q L，et al.Enhancement of hyperthermial induced apoptosis by nonthermal effects of ultrasound［J］.Cancer Lett，2002，178 (1):6370.

［8］BORIS K，EITAN K.Shear stress induced by a gas bubble pulsating in an ultrasonic field near a wall［J］.IEEE Transactions on Ultrasonics，Ferroelectrics，and Frequency Control，2004，51:973979.

［9］KIMIKO Y，TAKAAKI S，TETSURO W，et al.Fluid shear stress induces differentiation of Flk1positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，288:H1915H1924.

［10］TAO J，YANG Z，WANG J M，et al.Effects of fluid shear stress on eNOS mRNA expression and NO production in human endothelial progenitor cells［J］.Cardiology，2006，106(2):8288.

［11］TAO J，YANG Z，WANG J M，et al.Shear stress increases Cu/Zn SOD activity and mRNA expression in human endothelial progenitor cells［J］.J Hum Hypertens，2007，21(5):353358.