人脂肪干细胞体外培养及向软骨细胞诱导分化的实验研究

　　　　 作者：王中兴 ，鹿均先，熊传芝

【摘要】 目的：观察人脂肪基质干细胞（ADSCs）体外分离培养及成脂、成软骨诱导分化的生物学性状，探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法：（1）人脂肪组织来源于健康成年女性腹部吸脂术，酶消化法分离出ADSCs，体外培养扩增。（2）取第3代ADSCs，测细胞生长曲线，流式细胞仪测原代细胞表面标记；成脂和成软骨诱导分化。（3）倒置显微镜观察油红O、阿尔辛蓝（ABPSA）染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测分化情况；RTPCR检测相关标志基因表达。结果：（1）体外培养的ADSCs细胞形态均一，传代稳定。（2）经成脂诱导，细胞内出现空泡，油红O染色呈红色，RTPCR检测到有Leptin、PPARγ表达；经成软骨诱导，ABPSA染色呈紫红色，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色胞浆呈棕黄色，RTPCR检测COLLⅡ、SOX9和aggrecan表达。结论:脂肪干细胞能向软骨细胞方向诱导分化，可作为软骨组织工程种子细胞。

【关键词】 脂肪基质干细胞; 分化; 软骨; 组织工程

近年来组织工程学发展迅速，为骨科治疗顽疾带来了新的希望，但是如何获得大量的种子细胞却一直制约其发展，通常骨组织工程所用的骨髓基质干细胞（BMCs）由于难以分离和培养，限制了其成为良好的组织工程种子细胞来源。本实验通过对成人皮下脂肪组织来源干细胞的分离、培养、鉴定及向软骨定向诱导，以期建立获取脂肪来源干细胞和诱导其向软骨细胞分化的方法，为组织工程软骨的构建提供新的种子细胞。

1 材料和方法

　　1.1 材料

　　本实验所用脂肪组织来自于东南大学医学院附属徐州医院整形外科腹部吸脂者，均为女性，年龄20～45岁。Ⅰ型胶原酶为美国Worthington公司产品，DMEM粉剂为GIBCO公司产品，胎牛血清(FBS)为HYCLONE公司产品，兔抗人Ⅱ型胶原多克隆抗体及免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 脂肪基质干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）的分离培养 无菌条件下取脂肪组织，0.075%Ⅰ型胶原蛋白酶消化（放入37 ℃震颤水浴槽中60 min），1 200×g离心10 min，去除漂浮的脂肪细胞及上清液，DMEM培养液（含10％胎牛血清、100 μg·ml-1青霉素和100 μg·ml-1链霉素）重悬细胞，接种至培养皿中，以3×10 4 个有核细胞·cm-2密度接种，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度为100％的培养箱中孵育，48 h后首次换液，弃去未贴壁细胞。细胞生长至75％～90％融合时传代，每2～3 d更换培养液。

　　1.2.2 MTT法测生长曲线 取第3代细胞消化制备成单细胞悬液，调整细胞悬液浓度为1×107L-1，接种于24孔板，每孔接种1 ml，分8组，每组3孔，共24孔。每天计数1组，取3个孔的均值。绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间。

　　1.2.3 向脂肪细胞诱导 （1）取第3代细胞，以4.0×107L-1密度接种于预先放置了小玻片的24孔板，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。待细胞爬满玻片后用成脂诱导培养基(高糖DMEM、10%胎牛血清、0.5 mmol·L-1 IBMX、1 μmol·L-1地塞米松，10 μmol·L-1胰岛素、1%青链霉素原液)诱导分化2周，每72 h换液1次，相差显微镜观察。（2）成脂特性检测：取成脂诱导2周后的玻片，10%甲醛溶液固定10 min后水洗，于60%异丙醇溶液内侵洗。油红O染液染色10～15 min，双蒸水内洗，甘油明胶封固，显微镜下观察，RTPCR检测相关标志基因表达情况。

　　1.2.4 向成软骨诱导 （1）取接种于25 cm2培养瓶培养至第3代的细胞，用成软骨诱导培养基(高糖DMEM、1%胎牛血清、10 μg·L-1 TGFβ1、50 nmol·L-1抗坏血酸、6.25 mg·L-1胰岛素、1%青链霉素原液)诱导分化2周，相差显微镜观察。（2）成软骨特性检测。阿尔辛蓝（ABPSA）染色：4%多聚甲醛固定细胞，Alcian Blue染液(Alcian Blue 1.0 g、蒸馏水97 ml、冰醋酸3 ml)孵育30 min，蒸馏水洗，1%过碘酸水溶液氧化5～10 min，Schiff试剂染20 min，苏木精染核，甘油明胶封固。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：4%多聚甲醛固定细胞，蒸馏水洗，加0.2 U·ml-1软骨素酶ABC，37 ℃孵育30 min，加3%h3O2甲醇去除内源性过氧化氢酶的作用，蒸馏水洗，加5%BSA室温作用20 min，加1∶100稀释的兔抗人Ⅱ型胶原多克隆抗体，4 ℃孵育过夜。按试剂盒说明依次加入二抗、SABC和DAB显色，苏木精对比染色。RTPCR检测相关标志基因表达情况。

　　2 结　　果

　　2.1 原代ADSCs形态学观察

　　细胞接种后24 h开始贴壁，初为小圆形，直径5 μm，色深。48 h后大部分细胞已贴壁生长，呈梭形或多角形，细胞直径增加到20 μm左右，呈集落样生长（图1）。

　　2.2 细胞增殖活性测定

　　接种后的2 d内细胞种群处于停滞期，3～6 d为对数生长期，第8天进入平台期（图2）。细胞群体倍增时间为55 h。

　　2.3 原代细胞表面标记的鉴定

　　流式细胞仪检测显示，与干细胞相关的抗原CD105、CD106、CD166、CD29等表达率均大于60%；CD 49d表达率高达88.2%，与造血系统相关的抗原CD 34表达率为7.1%，与内皮细胞相关的抗原CD31表达率为28.7%。

　　2.4 向脂肪细胞诱导结果

　　细胞于诱导开始后即停止分裂增殖，逐渐由长梭形变成不规则的圆形，体积增大，但大小不一。最早于诱导后4 d即可在细胞内看到小的脂滴，脂滴逐渐增多，有的相互融合形成较大的脂滴。诱导14 d时细胞分化达到高峰，经油红O染色证实为脂滴（图3）。RTPCR检测到有Leptin、PPARγ表达（图4）。

　　2.5 向软骨细胞诱导结果

　　单个细胞形态无明显变化，随诱导时间延长，在细胞密度较大处细胞群逐渐聚集。诱导7 d后即可在聚集细胞的表面看到微黄色的物质积累，量逐渐增多，14 d时达到高峰。免疫组化显示ADSCs成软骨诱导后表达Ⅱ型胶原(图5)，RTPCR检测到COLLⅡ、SOX9、aggrecan表达(图6)；ABPSA染色的细胞分泌有中性或酸性黏多糖成分(图7)。

3 讨　　论

　　关节软骨损伤的修复仍是骨科临床面临的挑战之一。传统的治疗方法如骨软骨移植及关节置换术并不能完全恢复透明软骨的结构，组织工程学的兴起为关节软骨损伤治疗提供了新的选择［1］。组织工程软骨的构建中，关键的任务是寻找合适的种子细胞，自体和异体软骨细胞来源相对较少，骨髓来源的间充质干细胞取材相对困难而且只能获取到相对少量的干细胞。Zuk等［2］于2001年在人体皮下脂肪组织中提取到了具有多向分化能力的细胞，并称之为脂肪来源的成体干细胞(PLA或ADSCs)。脂肪组织临床较易大量获取而且对患者造成的痛苦较小，可获得的干细胞数量较多，体外扩增时间短，缩短了取材和将组织工程软骨植入患者体内的时间。因此，脂肪来源的干细胞作为组织工程软骨构建中种子细胞的新选择而日益受到重视。

　　本实验从人脂肪组织中成功分离出ADSCs，细胞增殖速度稳定，群体倍增时间约为55 h。细胞可传至10代以上，形态无明显改变。此外，在细胞分离、纯化过程中，一些混杂细胞(如红细胞、内皮细胞等)很难彻底清除，但其数量很少(占细胞群的5%～20%［3］)，而且，这些细胞会在随后的培养中逐渐减少。本实验通过流式细胞仪对细胞进行检测证实，到第3代时，细胞纯度可达到95%以上。

　　Mitchell等［4］通过实验发现，随着体外培养时间的延长，脂肪干细胞的间质细胞相关表型逐渐增加。本实验流式细胞仪检测显示，与干细胞相关的抗原CD105、CD106、CD166和CD29等表达率均大于60%;CD49d表达率高达88.2%，与造血系统相关的抗原CD34表达率为7.1%，与内皮细胞相关的抗原CD31表达率为28.7%，说明获得的原代细胞是由未分化的基质干细胞、内皮细胞、造血系细胞等组成的混合细胞群。由于目前还没有特异性的间充质干细胞表面标志，所以，流式细胞仪和免疫组化染色检测结果对干细胞的确认只能起到辅助作用。为进一步确认本实验所得细胞具有干细胞特性，对细胞进行了多系定向诱导，经特殊染色，RTPCR检测到Leptin、PPARγ等脂肪细胞特异表达基因及软骨细胞特异表达基因Aggrecan、SOX9以及Ⅱ/Ⅹ型胶原，证实可向成脂、成软骨方向分化。

　　本实验结果说明，人脂肪来源的间充质干细胞在一定的条件下可以定向诱导分化为软骨细胞。此外，吸脂术简单易行，取材量大，可反复操作，有利于干细胞自体移植的开展。因此，人ADSCs为我们展现出广泛的应用前景，有望成为良好的组织工程种子细胞来源。

参考文献

［1］VACANTI C A，VACANTI J P.Bone and cartilage reconstruction with tissue engineering approaches［J］.Otolaryngol Clin North Am，1994，27:263276.

［2］ZUK P A，ZHU M，MIZUNO H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell based therapies［J］.Tissue Eng，2001，7(2):211228.

［3］ROBERT L.干细胞手册［M］.北京:科学出版社，2006:425447.

［4］MITCHELL J B，MCINTOSH K，ZVONIC S，et al.Immunophenotype of human adiposederived cells：temporal changes in s tromalas sociated and stem cellassociated markers ［J］.Stem Cells，2006，24(2):376385.