【摘要】 目的 观察和探讨灵芝孢子粉对戊四氮（PTZ）致痫大鼠脑核转录因子-κB（NF-κB）免疫反应性的影响并进行行为学观测。方法 用亚惊厥剂量的PTZ复制大鼠慢性癫痫模型，用药组以灵芝孢子粉灌胃，记录癫痫发作的潜伏期及持续时间，采用免疫组织化学法检测脑NF-κB/P65的蛋白表达。结果 大鼠海马和皮质区每高倍视野（×400）下NF-κB/65蛋白表达模型组明显高于对照组（P&<0.01）；在造模第17、21、25天时用药组较模型组癫痫发作的潜伏期有所延长(P&<0.05或P&<0.01），海马和皮质区NF-κB/P65蛋白表达用药组低于模型组(P&<0.01或P&<0.05）。结论 NF-κB可能参与了PTZ致痫的发生发展过程，灵芝孢子粉能明显抑制NF-κB蛋白表达，抑制免疫炎症反应，降低神经系统兴奋性，对神经细胞具有保护作用。
【关键词】 癫痫；大鼠；模型，动物；灵芝孢子粉；核因子κB
Effects of ganoderma lucidum spores powder on the behaviors and immune reactivity of brain NF-κB in models of epilepsy in rats
ZHAO Shuang， ZHANG Sheng-chang， WANG Shu-qiu
(Department of Pathophysiology， Youjiang Medical College for Nationalities， Baise， Guangxi 533000， China; Department of Anatomy， Youjiang Medical College for Nationalities， Baise， Guangxi 533000， China; Department of Pathophysiology， Basic Medical College of Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007， China)
Abstract: Objective To investigate the effects of ganoderm lucidum spores powder on the behaviors and immune reactivity of brain nuclear factor-κB (NF-κB) in rats with epilepsy induced by pentetrazole (PTZ). Methods The models of chronic epilepsy in rats were produced by sub-eclampsia dose of PTZ. The drug group received intragastric ganoderm lucidum spores powder infusion while injecting with PTZ intraperitoneally. The latency period and duration of epileptic seizures were recorded. The immunohistochemical staining was used to measure the immune reactivity of brain NF-κB/P65 protein. Results Under each high power microscope sight (×400)， the level of NF-κB/P65 protein in hippocampus and brain cortex for epileptic model group was higher than that for normal control group (P&<0.01). And compared with epileptic model group， the latency period of epileptic seizures for drug group was longer on days 17， 21 and 25 (P&<0.05 or P&<0.01)， the level of NF-κB/P65 protein in hippocampus and brain cortex for drug group was lower than epileptic model group (P&<0.01 or P&<0.05). Conclusion NF-κB may be involved in the occurrence and development of PTZ-induced epilepsy， ganoderma lucidum spores powder can down-regulate the expression of NF-κB， inhibit immune inflammatory reaction and decrease the excitability of nervous system， so it has protective effects on nerve cells.
Key words: epilepsy; rats; models， animals; ganoderma lucidum spores powder; nuclear factor-kappa B
癫痫是以大脑神经细胞群反复超同步放电引起的发作性、突然性、短暂性脑功能紊乱为特征，以反复痫样发作为表现的临床征候群，其发病机制尚未完全清楚。癫痫致脑损伤已被许多动物实验和临床观察所证实，癫痫作为一种免疫相关性神经系统疾病，其发生发展与细胞因子及各种脑神经肽有着密切关联。灵芝是一种珍贵的药用真菌，传统的药用部位仅限于其子实体，近年来随着人工栽培技术的发展，其生殖细胞——灵芝孢子（粉）（ganoderma lucidum spore powder）作为灵芝的又一药用部位逐渐为人们所认识，灵芝孢子粉是灵芝发育后期弹射释放出来的种子，生物学上称担孢子，集中起来后呈粉末状。灵芝孢子粉作为一种名贵中药，含有丰富的氨基酸和微量元素，具有免疫调节、清除自由基、提高机体耐缺氧能力等作用，且对神经系统具有镇静和保护功能［1］。本研究观察灵芝孢子粉对戊四氮（PTZ）致痫大鼠脑核转录因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）免疫反应性的影响，并进行行为学观测，以进一步探讨癫痫的发病机制及灵芝孢子粉的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠30只(由佳木斯大学实验动物中心提供)，体重为（200±20）g。
1.2 药品试剂及仪器 PIZ（美国SIGMA公司生产）；灵芝孢子粉（佳木斯市野生灵芝种植基地）；免疫组化检测试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）；BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟生物科技公司）。
1.3 方法
1.3.1 动物分组及癫痫模型复制 将大鼠随机分为正常对照组、癫痫模型组和灵芝孢子粉用药组，每组10只。参照Morgan等［2］方法并略加改动。PTZ用前以生理盐水新鲜配制成溶液(10g/L)，灵芝孢子粉用药组和癫痫模型组用PTZ亚惊厥量(35mg/kg)行腹腔注射，每日1次，持续28天，空白对照组以等容生理盐水代替PTZ腹腔注射。用药组腹腔注射PTZ的同时再经灌胃给予灵芝孢子粉(30g/L)，灌胃前禁食6h，灌胃体积为10.0ml/kg，每日1次，持续28天；模型组和对照组同时经灌胃给予同体积生理盐水。大鼠痫性发作评分标准为［3］：0级，无行为上的发作反应；Ⅰ级，节律性点头或嘴、面部抽动；Ⅱ级，阵挛性咀嚼或点头甩尾；Ⅲ级，头部颤搐加前肢阵挛性抽搐；Ⅳ级：多肢抽动或袋鼠姿势；Ⅴ级，全面性持续强直-阵挛发作。每天对每只大鼠在PTZ注射后观察30～60min，并记录癫痫发作的级别、发作潜伏期(s)（即注入PTZ到首次痫性发作之间经历的时间）及发作持续时间(s)，凡出现连续5天Ⅱ级以上痫性发作的大鼠视为达到点燃标准。
1.3.2 标本留取 断头处死大鼠后取脑，立即分离出海马区组织，吸去血迹，置4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，6μm切片备检。
1.3.3 NF-κB/P65免疫反应性检测 石蜡切片经常规脱蜡水化后，用过氧化物酶阻断剂阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗后，再用成套sABC免疫组织化学试剂盒检测NF-κB/P65表达水平。一抗分别为兔抗大鼠NF-κB/P65抗体，以PBS代替一抗作为阴性对照，具体操作步骤按sABC免疫组织化学试剂盒说明书进行。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。并于光镜下观察NF-κB/P65阳性细胞表达情况，每张切片海马及皮质区各选取6个具有代表性的非重叠高倍视野(×400)，计算每视野下平均阳性细胞数。
1.4 统计学处理 实验中所得数据均以±s表示，均数间显著性差异判定运用SPSS for Windows 10.0统计软件包进行方差分析及t检验。
2 结果
2.1 行为学观察 癫痫模型组及灵芝孢子粉用药组大鼠在每天注射PTZ后均有不同程度痫性发作表现，每次发作持续1～20min不等，到PTZ注射第28天时以上两组动物均有连续多次Ⅲ～Ⅴ级痫性发作，癫痫模型复制成功。并分别记录了从第1天注射PTZ后即造模过程中第1、5、9、13、17、21、25天时癫痫发作潜伏期(s)及持续时间(s)。用药组与模型组相比，第1、5、9、13天时发作潜伏期差异无显著性（P&>0.05）；而第17、21、25天时发作潜伏期差异有显著性（P&<0.05或P&<0.01），见图1。对照组大鼠则无任何异常行为表现。
图1 造模过程中模型组与用药组癫痫发作潜伏期比较（略）
2.2 各组海马和皮质区神经细胞NF-κB蛋白表达情况 NF-κB被激活后转位入核，细胞核呈黄褐色或深棕色，苏木素不能复染，视作阳性细胞。光镜下，对照组仅有极少散在的NF-κB/P65阳性细胞；而模型组中NF-κB/P65阳性细胞数明显多于对照组（P&<0.01）。用药组中NF-κB免疫反应减弱，阳性细胞数明显减少，与模型组比较，差异有显著性（其中海马P&<0.01；皮质P&<0.05），见表1。
表1 各组海马和皮质区NF-κB/P65蛋白表达水平 （略）
与对照组比较，a：t=18.98，b：t=13.12，P均&<0.01；与模型组比较，c：t=9.25，P&<0.01，d：t=2.72，P&<0.05
3 讨论
在中枢神经系统中［4］，NF-κB作为一种重要的“应激传感器”，可通过其活化形式进入细胞核结合于DNA上相应位点，对外界刺激作出快速反应，上调c-fos、c-jun、p53等靶基因的转录，神经细胞进入激活状态。NF-κB还可作为多级基因调控蛋白，调控神经突触重组过程［5］。海马神经细胞活化即NF-κB/P65的核转位是PTZ点燃大鼠癫痫形成的重要机制之一［6］。NF-κB在癫痫脑损伤中的作用机制为：促进炎症的发生发展；诱导神经细胞凋亡；介导自由基损伤；参与NMDA和Ca2+超载介导的神经损伤［7］。
灵芝孢子粉含有大量的蛋白质、糖类、脂肪酸等营养物质和丰富的维生素等天然抗氧化成分，可增加血红蛋白含量，提高机体携氧能力，有效清除痫性发作生成的自由基，并具有营养大脑，提供能量及免疫调节作用［1］。据本实验结果可知，灵芝孢子粉的有效成分能充分作用于脑组织，可能是通过其有效的抗氧化损伤和抑制免疫炎症反应发生发展，使NF-κB的激活得到控制。本实验中，用药组在PTZ致痫第17、21、25天时，其发作潜伏期较模型对照组明显延长，说明灵芝孢子粉可能通过改变神经递质水平、调节神经受体、影响能量代谢及调控这些机制的基因表达等改善皮质及海马区的神经电生理功能，可通过抑制免疫炎症反应发生发展纠正异常重组的神经网络，从而抑制神经元同步放电，降低神经系统兴奋性。
总之，通过本研究表明，灵芝孢子粉可明显抑制PTZ致痫大鼠脑NF-κB免疫反应性，对神经细胞具有保护作用。灵芝孢子粉作为一种治疗癫痫的辅助用药，在临床应用上将具有广阔前景。
参考文献
［1］ 赵春，张雪辉.灵芝抱子粉的耐缺氧作用观察［J］.云南中医中药杂志，2002，2(6):26-27.
［2］ Morgan JI， Cohen DR， Hempstead JI， et al. Mapping pattern of c-fos expression in the central nervous system after seizure ［J］. Science，1987，237(3):192-197.
［3］ Martina EV， Uta R， Peter M， et al. Pentylenetetrazole(PTZ)-induced c-fos expression in the hippocampus of kindled rats in suppressed by concomitant treatment with Naloxone ［J］. Brain Res，1998，792(3):299-308.
［4］ Mattson MP， Culmsee C， Yu Z， et al. Roles of nuclear factor κB in neuronal survival and plasticity ［J］. Neurochem，2000，74(2):443-456.
［5］ Silva Brum LF， Elisabersky E. Antiepileptogenic properties of phenobarbital:behavior and neurochemical analysis ［J］. Pharmacol Biochem Behav，2000，67(3):411-441.
［6］ 王开颜，阮旭中，朱遂强，等.海马神经细胞活化在戊四氮点燃大鼠癫痫形成过程中的作用［J］.中风与神经疾病杂志，2001，18(6):347-349.
［7］ Clemens JA. Cerebral ischemia:gene activation，neuronal injury，and the protective role of antioxidants ［J］. Free Radic Biol Med，2000，28(10):1526-1531.