阿特拉津分子印迹固相萃取柱的制备及应用

　　 作者：王颜红 霍佳平， 张红 王世成 司士辉 林桂凤 李国琛 刘伟

【摘要】 以阿特拉津为模板分子，α甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，65 ℃聚合17 h，制备了对阿特拉津具有特异性识别的分子印迹聚合物。将聚合物研磨、过筛、洗涤并装柱，制备分子印迹固相萃取柱，其最大结合量比游离态的聚合物微球高600倍，结合时间为游离态的1/60，采用液相色谱法检测其回收率达90%;用于富集水样中含量低于2×10-8 mol/L的待测物，其回收率也可达到89.3%。与市售C18柱相比，分子印迹固相萃取柱回收时间仅为C18柱的1/3，试剂用量为其1/4，但回收率更好，净化更彻底，减少了杂质峰对分析的影响，提高了灵敏度，利于仪器的保护和保养。应用此方法对实际农业水样进行了检测，结果满意。

【关键词】 分子印迹聚合物; 阿特拉津; 模板分子; 固相萃取; 液相色谱

　1 引 言

　　分子印迹技术(Molecularly imprinted technology， MIT)多用于合成具有识别特性的印迹聚合物。由于印迹过程是将与目标分子(TM)具有结构互补的功能化聚合单体通过共价键或非共价键与目标分子结合，反应完全后洗脱目标分子，从而形成有固定孔穴大小和形状及确定功能团排列顺序的交联高聚物[1]，并具有专一识别性强、可再生等优势，有广泛的应用前景。目前，MIT已应用于传感器[2]、人工抗体模拟[3]及色谱固相分离[4～6]等方面，已成为化学和生物学交叉的新兴领域之一。

　　阿特拉津是一种广泛使用的三嗪类除草剂，其在土壤中半衰期较长，甚至残留于部分地区的地下水和地表水中，被列为环境荷尔蒙的可疑物质[7]，对人体有潜在的“致畸、致癌、致突变”作用[8]。因此，对此类除草剂的分析和研究具有重要意义。Amalric等[9]在2008年利用光聚合制备了分子印迹物质，并将其应用于固相萃取，以二氯甲烷为溶剂，检测了农业集水区土壤中残留的阿特拉津及其代谢物的含量。胡玉玲等[10]制备了另一种三嗪类除草剂特丁津分子的印迹整体萃取棒，并对其萃取性能进行了研究。本研究在水质中将阿特拉津富集和分离，热聚合17 h制备分子印迹固相萃取柱。与市售C18柱相比，本萃取柱具有回收时间短，试剂用量少，回收率高，净化效果好等优点。应用此方法对实际农业水样进行了检测，结果满意。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　Waters 6002487高效液相色谱仪(美国Waters公司); S450扫描电子显微镜、EiKoIB5离子溅射仪(日本日立公司);ASE12固相萃取仪(天津奥特赛思仪器有限公司);KQ250B超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

　　阿特拉津(97%，浙江长兴中山第一化工有限责任公司);偶氮二异丁腈(AIBN，化学纯，天津博迪化工有限公司);α甲基丙烯酸(MAA，分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司); 乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，98%，上海晶纯试剂有限公司); 甲醇、甲苯(分析纯，天津市康科德科技有限公司); 去离子水，MillQ超纯水。2.2 分子印迹聚合物的制备

　　将154 μL MAA，0.08 g 阿特拉津溶于甲苯中，超声混匀，加入3.04 mL EDMA和6.96 mg AIBN[11]至10 mL硬质试管中，超声混匀，氮吹10 min，除去溶解氧，密封，在65 ℃水浴聚合17 h，得棒状聚合物。将聚合物研碎，过400目筛，用甲醇乙酸(9∶1， V/V)洗至紫外检测不到阿特拉津，继续用甲醇索式抽提洗至中性，丙酮反复沉降至少3次，除去悬浮粉末，得到分子印迹聚合物(MIPs)，50 ℃真空干燥至恒重。空白聚合物除不加阿特拉津目标物外，其余与印迹聚合物合成条件相同。

　　2.3 MIPs结合能力的测定

　　称取20.0 mg MIPs，置于10 mL具塞三角瓶中，加入1 mL不同浓度阿特拉津的甲醇溶液，放入恒温振荡器中振荡16 h，分别离心。取适量上清液，用HPLC测定阿特拉津的游离浓度，根据结合前后浓度的变化计算聚合物对目标分子的最大结合量Qmax。

　　2.4 MIPs萃取柱的性能研究

　　取50 mg MIPs干法装柱，制得固相萃取柱，依次用3 mL甲苯、1 mL 1.88 μmol/L阿特拉津的甲苯溶液、纯甲苯、1 mL甲醇过柱，收集洗脱液，用N2吹干，以甲醇定容至1 mL， 进行HPLC检测(液相色谱检测前，样品保存在-70 ℃冰箱中)。

　　2.5 MIPs柱、C18柱对水质中阿特拉津的富集和分离

　　取2.4中制得的MIPs柱，用3 mL甲苯活化柱子，再用3 mL甲醇和3 mL水润洗，将100 mL 2×10-8 mol/L阿特拉津的水溶液以1 mL/min的流速过柱，用1 mL水淋洗，阿特拉津用1.5 mL甲醇洗脱。过柱后的残余液在旋转蒸发仪上蒸至近干，用1 mL甲醇复溶，进行HPLC检测，甲醇洗脱液用N2吹干并重新定容，再进行HPLC检测，样品平行测定3次。

　　取市售的C18固相萃取柱，依次用5 mL乙酸乙酯、5 mL丙酮和5 mL去离子水润洗C18柱，将100 mL 2×10-8 mol/L阿特拉津的水溶液以1 mL/min的流速过柱，N2吹干C18柱，再用6 mL乙酸乙酯淋洗柱子[12]，收集洗脱液，N2吹干并用1 mL甲醇定容，进行HPLC检测，样品平行测定3次。

　　2.6 液相色谱测定阿特拉津条件

　　Symmetry C18 色谱柱(150 mm×4.6 mm， 5 μm)，柱温30 ℃;流动相为 CH3OHh3O(1∶1， V/V)，流速为1.0 mL/min;进样量为20 μL，检测波长为220 nm。

　　3 结果与讨论

　　3.1 模板分子与功能单体的作用机理

　　阿特拉津MIPs是通过阿特拉津和MAA间的非共价作用力(氢键、静电作用等)形成的具有可逆特性的高聚物。阿特拉津分子中乙氨基和异丙氨基上与N相连的H+与MAA形成氢键，从而形成分子结构印迹(见图1)。在此反应中，EDMA即作为溶剂又作为交联剂(CL)， 图2 MIP扫描电镜图

　　Fig.2 Scanning electron micrographs of atrazine molecularly imprinted polymer甲苯即作为溶剂又充当致孔剂，在引发剂AIBN存在的条件下，高聚物出现网状结构，扫描电镜测试结果可以表征其整体聚合物的形态(见图2)。运用化学方法除去目标分子，可以形成具有特殊空穴的支架结构。这种特殊空穴具有记忆能力，存在与目标化合物特异性的结合作用，聚合物内部存在着一些官能团和构型与目标分子相匹配的位点。

　　3.2 溶剂用量选择

　　确定n1(TM)∶n2(FM)∶n3(CL)=1∶4∶20[13]后，用甲苯作溶剂，取不同溶剂配比(见表1)制备MIPs柱。表1 不同溶剂配比的MIPs柱的作用效果样液中阿特拉津绝对量(Atrazine in sample): 2×10-9 mol。 结果表明，第一组的萃取时间分别是第二组和第三组的50%和31%;第一组的回收率较第二组和第三组提高了和5%和6%。由此可见，第一组(1∶4∶20∶24)的溶剂配比可使MIPs柱萃取时间最短，过柱后的流出液中未检出阿特拉津，洗脱后回收率最高，达到90%，实现较好的柱效。

　　3.3 结合能力比较

　　在2.3和2.4节的条件下分别进行结合量的测定，装柱前的最大结合量可以通过Scatchard方程[14]进行计算：Q/C=(Qmax-Q)/Kd表2 不同状态MIPs结合作用效果

　　Maximum adsorption (mmol/g)0.02716.8 MIPs用量(Content of MIPs): 20 mg。 式中，Kd是结合位点的平衡离解常 数，Qmax是结合位点的最大表观结合量， C为吸附液中的目标分子的平衡浓度。根据上式，以Q/C对Q作图，可求得最大结合量。装柱后MIPs的最大结合量则可通过上柱前后的目标物含量的变化计算得出(见表2)。 装柱后的最大结合量为16.8 mmol/g，是装柱前的600倍，结合时间为15 min，仅为装柱前的1/60。由此可见，装柱过程显著提高了MIPs的结合能力和效率。

　　3.4 MIPs柱与C18柱的萃取效果比较

　　比较MIPs柱与C18柱的萃取作用效果，前者在过柱后的流出液中几乎不再含目标分子，洗脱试剂的用量仅是后者的25%，浓缩时间是后者的2/3，且取得了满意的回收率(见表3)。

　　MIPs柱以分子印迹物上留有的记忆空穴作为结合位点，对目标分子产生特异性的吸附，并以一种较弱的化学键相作用。C18柱则是基于简单的物理吸附，因此MIPs柱吸附目标分子更有选择性，当MIPs改变溶剂极性时，这种较弱的化学键较易断裂，目标分子则更易洗脱，而物理吸附对目标化合物的吸附虽与洗脱溶剂的极性有关，但其对化合物的选择性不强。表3 MIPs柱及C18柱的作用效果

　　1. 阿特拉津(Atrazine)。量分别为1.785×10-9 mol和1.816×10-9 mol; 回收率分别达89.3%和90.8%。与C18柱相比，MIPs柱对样品的净化效果更佳(见图3)，干扰峰更少，提高了检测灵敏度，也利于延长色谱柱的使用寿命。

　　3.6 实际农业用水的分析

　　采用此方法对实际农业灌溉用水中的残留阿特拉津进行固相萃取，取100 mL水样进行富集、洗脱并浓缩后，液相色谱检测，样品平行测定3次。过柱后流出液中均未检测出阿特拉津;洗脱液中阿特拉津的含量分别为0.90×10-9 mol， 0.83×10-9 mol和0.88×10-9 mol， RSD为4.14%。 本方法应用于实际水样检测的前处理，结果令人满意。

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