作者：王秀文，赵慧辉，刘养清，刘晓芳，程若敏，刘小玉
【摘要】 目的 研究不同生长年限山西党参的指纹图谱，为科学评价党参的内在质量提供参考。方法 采用RP-HPLC法，色谱柱：GraceSmart RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1% 冰醋酸为流动相，流量0.6 mL/min，检测波长为268 nm，柱温30 ℃。结果 党参样品HPLC指纹图谱可明显显示不同年限党参样品的差异性和相似性，精密度、稳定性和重复性试验的RSD均＜3%，用党参炔苷作为参照物可确认党参样品中的活性成分。结论 本方法操作简便，结果稳定可靠，且利用指纹图谱的整体性，可以对山西党参药材的质量控制提供有益的参考。
【关键词】 党参；不同生长年限；党参炔苷；指纹图谱；反相高效液相色谱法
Abstract：Objective Chromatography fingerprint of Radix Codonopsis of different age from Shanxi province was studied to provide the reference for the science appraisal of intrinsic quality of Radix codonopsis. Method A RP-HPLC method was applied on GraceSmart-RP18 (250 mm×4.6 mm， 5 μm) column with acetonitrile-0.1% acetic acid gradient elution as mobile phase， and the flow-rate was 0.6 mL/min. The detection wavelength was at 268 nm and the column temperature was at 30 ℃. Result Chromatography fingerprint of Radix Codonopsis can demonstrate obviously the difference and the similarity of Radix Codonopsis of different age. The RSD were lower than 3% in the precision， stability and the repetitiveness trial， and the codonopsis pilosula alkyne glucoside can be used as the reference to identify the active composition of Radix Codonopsis. Conclusion The method was simple， reproducible and reliable. The integrity of fingerprint can be used to supply the reference for the quality control of Radix Codonopsis from Shanxi provice.
Key words：Radix Codonopsis；different age；codonopsis pilosula alkyne glucoside；chromatography fingerprint；RP-HPLC
党参为我国传统名贵中药材之一，被广泛应用于临床，因而其内在质量也是人们关注的问题之一。目前，有文献报道通过测定党参药材中单一指标的含量[1-2]来表征党参的质量，但这不足以全面衡量党参的质量；也有学者研究某一产地党参的指纹图谱[3-5]，但报道不多。党参为山西的道地药材之一，但有关山西党参的指纹图谱，特别是不同生长年限的山西党参指纹图谱还未见报道。为了保证临床用药的安全性和有效性，本试验以党参炔苷作为指标成分，建立了党参的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱分析方法，以期对山西党参药材的质量控制提供有益的参考。
1 仪器与试药
HANGPNG FA电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；DIONEX高效液相色谱仪，PDA检测器，色谱柱为GraceSmart RP18；SK8200H超声清洗机(上海科导超声仪器有限公司)。
潞党参(2年生、3年生、5年生)，山西平顺；陵川党参(1年生、2年生、3年生)，陵川县六泉乡黄松背村。党参炔苷对照品(上海友思生物技术有限公司)。乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20080915)，冰醋酸(HAC，天津市巨星圣源化学试剂有限公司)。
2 方法
2.1 色谱条件
色谱柱：GraceSmart RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%HAC，流量0.6 mL/min；检测波长为268 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。理论塔板数按党参炔苷计算不低于5 000。梯度洗脱程序见表1。表1 梯度洗脱程序（略）
2.2 对照品溶液的制备
取党参炔苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶液，稀释为一定浓度，备用。
2.3 样品溶液的制备
准确称取党参样品约0.3 g，加无水乙醇5 mL，超声提取25 min，滤过，再加无水乙醇5 mL，超声提取15 min，滤过，再加无水乙醇4 mL，超声提取10 min，滤过。合并3次滤液，浓缩，用无水乙醇洗涤并定容到5 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
3 结果(见图1～图3)
由图2和图3可知，无论是潞党参还是陵川党参，其指纹图谱均有21、29、37、42 min 4个共有峰，其中42 min的峰为党参炔苷的峰，但4个共有峰所代表的物质的相对含量是不同的，这反映了不同产地党参指纹图谱的差异性。
由图2可知，2年生潞党参在28 min和42 min附近的峰，其峰面积比3年生、5年生的明显大。从图3可以看出，1年生陵川党参在28 min和42 min附近的峰面积比2年生、3年生的明显大，而且陵川1年生党参在约43 min和45 min处的峰很明显，其面积也比2年生和3年生的大很多。这可能是党参的这些成分在生长过程中逐步分解或转化为其他物质，是否如此还有待进一步考证。另外，我们发现无论是潞党参还是陵川党参，低生长年限的党参在21 min和37 min附近峰的峰面积与高生长年限的区别不大。因此，山西党参不同生长年限的区别主要在于28 min和42 min及43 min和45 min处的峰的大小。对于潞党参来说2年生的较好，而对于陵川党参来说1年生的较好，但考虑到经济效益问题，也是2年生较为适宜。
4 方法学考察
4.1 精密度试验
准确称取陵川2年生党参药材，按“2.3”项下方法制备供试品1份，进样量10 μL，连续进样6次，测得党参炔苷的保留时间RSD＝0.062%、峰面积RSD＝0.17%。由此可知，此方法的精密度良好。
4.2 稳定性试验
准确称取陵川2年生党参药材，按“2.3”项下方法制备供试品1份，进样量10 μL，分别在0、1、2、3、4、8 h测定其指纹图谱，测得党参炔苷峰面积RSD＝2.3%。结果表明，供试品溶液在8 h内稳定。
4.3 重复性试验
准确称取陵川2年生党参药材，按“2.3”项下方法制备供试品5份，进样量10 μL，测定药材的指纹图谱，测得党参炔苷峰面积RSD＝2.9%。结果表明，测定方法的重复性良好。
5 讨论
5.1 检测波长的选择
本试验对在波长210、254、268、272 nm下扫描的指纹图谱进行分析比较，结果发现，在268 nm波长下扫描的指纹图谱各峰分离良好，峰数目也比较多，而且党参炔苷有最大吸收，故选用268 nm作为适宜的检测波长。
5.2 提取溶剂的选择
本试验分别采用甲醇、50%甲醇、无水乙醇、75%乙醇、无水乙醇-氯仿(1∶1)混合溶剂和无水乙醇-乙酸乙酯(1∶1)混和溶剂作为提取溶剂，结果表明：采用无水乙醇-氯仿(1∶1)或无水乙醇-乙酸乙酯(1∶1)这两种混和溶剂提取到的成分都较少，而使用无水乙醇作为提取溶剂，提取量高，干扰少，重复性好。故选用无水乙醇作为本试验的提取溶剂。
5.3 酸度选择
本试验对不同浓度的HAC作为流动相进行了研究，结果表明，当采用0.0%HAC时，党参炔苷的峰不出现，而采用0.3%HAC或0.1%HAC作为流动相，两者效果差异不大，为了节约试剂和减少酸对高效液相色谱仪的腐蚀，本试验采用0.1%HAC作为流动相的成分之一。
参考文献
[1] 王润生，刘养清，郭继龙，等.山西党参药材中党参炔苷的含量分析[J].药物分析杂志，2007，27(8)：1229－1231.
[2] 宋 丹，程雪梅，李隆云，等.HPLC测定不同产地川党参中党参炔苷的含量[J].中国中药杂志，2008，33(17)：2133－2135.
[3] 宋 丹，程雪梅，李隆云，等.川党参的高效液相色谱指纹图谱研究[J].中国药学杂志，2008，43(15)：1136－1139.
[4] 封士兰，胡芳弟，刘 欣，等.HPLC研究甘肃产白条党参指纹图谱[J].中成药，2005，27(7)：745－748.
[5] 向 一，祁 智，马长清，等.党参药材毛细管气相色谱指纹图谱研究[J].华中科技大学学报(医学版)，2006，35(6)：725－727.
【摘要】 目的 研究不同生长年限山西党参的指纹图谱，为科学评价党参的内在质量提供参考。方法 采用RP-HPLC法，色谱柱：GraceSmart RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1% 冰醋酸为流动相，流量0.6 mL/min，检测波长为268 nm，柱温30 ℃。结果 党参样品HPLC指纹图谱可明显显示不同年限党参样品的差异性和相似性，精密度、稳定性和重复性试验的RSD均＜3%，用党参炔苷作为参照物可确认党参样品中的活性成分。结论 本方法操作简便，结果稳定可靠，且利用指纹图谱的整体性，可以对山西党参药材的质量控制提供有益的参考。
【关键词】 党参；不同生长年限；党参炔苷；指纹图谱；反相高效液相色谱法
Study on RP-HPLC Chromatography Fingerprint of Radix Codonopsis of Different Age from Shanxi province
WANG Xiu-wen， ZHAO Hui-hui， LIU Yang-qing， et al
(Shanxi College of TCM， Taiyuan 030024， China；Beijing University of TCM， Beijing 100029， China)
Abstract：Objective Chromatography fingerprint of Radix Codonopsis of different age from Shanxi province was studied to provide the reference for the science appraisal of intrinsic quality of Radix codonopsis. Method A RP-HPLC method was applied on GraceSmart-RP18 (250 mm×4.6 mm， 5 μm) column with acetonitrile-0.1% acetic acid gradient elution as mobile phase， and the flow-rate was 0.6 mL/min. The detection wavelength was at 268 nm and the column temperature was at 30 ℃. Result Chromatography fingerprint of Radix Codonopsis can demonstrate obviously the difference and the similarity of Radix Codonopsis of different age. The RSD were lower than 3% in the precision， stability and the repetitiveness trial， and the codonopsis pilosula alkyne glucoside can be used as the reference to identify the active composition of Radix Codonopsis. Conclusion The method was simple， reproducible and reliable. The integrity of fingerprint can be used to supply the reference for the quality control of Radix Codonopsis from Shanxi provice.
Key words：Radix Codonopsis；different age；codonopsis pilosula alkyne glucoside；chromatography fingerprint；RP-HPLC
党参为我国传统名贵中药材之一，被广泛应用于临床，因而其内在质量也是人们关注的问题之一。目前，有文献报道通过测定党参药材中单一指标的含量[1-2]来表征党参的质量，但这不足以全面衡量党参的质量；也有学者研究某一产地党参的指纹图谱[3-5]，但报道不多。党参为山西的道地药材之一，但有关山西党参的指纹图谱，特别是不同生长年限的山西党参指纹图谱还未见报道。为了保证临床用药的安全性和有效性，本试验以党参炔苷作为指标成分，建立了党参的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱分析方法，以期对山西党参药材的质量控制提供有益的参考。
1 仪器与试药
HANGPNG FA电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；DIONEX高效液相色谱仪，PDA检测器，色谱柱为GraceSmart RP18；SK8200H超声清洗机(上海科导超声仪器有限公司)。
潞党参(2年生、3年生、5年生)，山西平顺；陵川党参(1年生、2年生、3年生)，陵川县六泉乡黄松背村。党参炔苷对照品(上海友思生物技术有限公司)。乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20080915)，冰醋酸(HAC，天津市巨星圣源化学试剂有限公司)。
2 方法
2.1 色谱条件
色谱柱：GraceSmart RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%HAC，流量0.6 mL/min；检测波长为268 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。理论塔板数按党参炔苷计算不低于5 000。梯度洗脱程序见表1。表1 梯度洗脱程序（略）
2.2 对照品溶液的制备
取党参炔苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶液，稀释为一定浓度，备用。
2.3 样品溶液的制备
准确称取党参样品约0.3 g，加无水乙醇5 mL，超声提取25 min，滤过，再加无水乙醇5 mL，超声提取15 min，滤过，再加无水乙醇4 mL，超声提取10 min，滤过。合并3次滤液，浓缩，用无水乙醇洗涤并定容到5 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
3 结果(见图1～图3)
由图2和图3可知，无论是潞党参还是陵川党参，其指纹图谱均有21、29、37、42 min 4个共有峰，其中42 min的峰为党参炔苷的峰，但4个共有峰所代表的物质的相对含量是不同的，这反映了不同产地党参指纹图谱的差异性。
由图2可知，2年生潞党参在28 min和42 min附近的峰，其峰面积比3年生、5年生的明显大。从图3可以看出，1年生陵川党参在28 min和42 min附近的峰面积比2年生、3年生的明显大，而且陵川1年生党参在约43 min和45 min处的峰很明显，其面积也比2年生和3年生的大很多。这可能是党参的这些成分在生长过程中逐步分解或转化为其他物质，是否如此还有待进一步考证。另外，我们发现无论是潞党参还是陵川党参，低生长年限的党参在21 min和37 min附近峰的峰面积与高生长年限的区别不大。因此，山西党参不同生长年限的区别主要在于28 min和42 min及43 min和45 min处的峰的大小。对于潞党参来说2年生的较好，而对于陵川党参来说1年生的较好，但考虑到经济效益问题，也是2年生较为适宜。
4 方法学考察
4.1 精密度试验
准确称取陵川2年生党参药材，按“2.3”项下方法制备供试品1份，进样量10 μL，连续进样6次，测得党参炔苷的保留时间RSD＝0.062%、峰面积RSD＝0.17%。由此可知，此方法的精密度良好。
4.2 稳定性试验
准确称取陵川2年生党参药材，按“2.3”项下方法制备供试品1份，进样量10 μL，分别在0、1、2、3、4、8 h测定其指纹图谱，测得党参炔苷峰面积RSD＝2.3%。结果表明，供试品溶液在8 h内稳定。
4.3 重复性试验
准确称取陵川2年生党参药材，按“2.3”项下方法制备供试品5份，进样量10 μL，测定药材的指纹图谱，测得党参炔苷峰面积RSD＝2.9%。结果表明，测定方法的重复性良好。
5 讨论
5.1 检测波长的选择
本试验对在波长210、254、268、272 nm下扫描的指纹图谱进行分析比较，结果发现，在268 nm波长下扫描的指纹图谱各峰分离良好，峰数目也比较多，而且党参炔苷有最大吸收，故选用268 nm作为适宜的检测波长。
5.2 提取溶剂的选择
本试验分别采用甲醇、50%甲醇、无水乙醇、75%乙醇、无水乙醇-氯仿(1∶1)混合溶剂和无水乙醇-乙酸乙酯(1∶1)混和溶剂作为提取溶剂，结果表明：采用无水乙醇-氯仿(1∶1)或无水乙醇-乙酸乙酯(1∶1)这两种混和溶剂提取到的成分都较少，而使用无水乙醇作为提取溶剂，提取量高，干扰少，重复性好。故选用无水乙醇作为本试验的提取溶剂。
5.3 酸度选择
本试验对不同浓度的HAC作为流动相进行了研究，结果表明，当采用0.0%HAC时，党参炔苷的峰不出现，而采用0.3%HAC或0.1%HAC作为流动相，两者效果差异不大，为了节约试剂和减少酸对高效液相色谱仪的腐蚀，本试验采用0.1%HAC作为流动相的成分之一。
参考文献
[1] 王润生，刘养清，郭继龙，等.山西党参药材中党参炔苷的含量分析[J].药物分析杂志，2007，27(8)：1229－1231.
[2] 宋 丹，程雪梅，李隆云，等.HPLC测定不同产地川党参中党参炔苷的含量[J].中国中药杂志，2008，33(17)：2133－2135.
[3] 宋 丹，程雪梅，李隆云，等.川党参的高效液相色谱指纹图谱研究[J].中国药学杂志，2008，43(15)：1136－1139.
[4] 封士兰，胡芳弟，刘 欣，等.HPLC研究甘肃产白条党参指纹图谱[J].中成药，2005，27(7)：745－748.
[5] 向 一，祁 智，马长清，等.党参药材毛细管气相色谱指纹图谱研究[J].华中科技大学学报(医学版)，2006，35(6)：725－727.