作者：姜旭光 姜明霞 荆雪宁 张新鹃 孙永庆 刘桂君 姜庆 张洪真
【摘要】 ：目的 观察临床治疗类风湿性关节炎使用频率最高的解表药(麻黄)、祛风湿药(川乌)、活血药(当归)及其复方合剂对佐剂性关节炎大鼠的影响，并研究其配伍规律。方法 把有相似作用的药物配成常用药对，制成麻桂合剂、制川草乌合剂、归芎合剂、复方合剂、低剂量复方合剂，并以正常组、造模组、雷公藤组做对比。用ELISA法和分光光度计测量足爪肿瘤坏死因子α(TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)的水平，测定免疫器官的脏器重量指数，分析不同药物组对免疫功能的影响。结果 造模组足爪PGE2、TNF-α水平明显高于正常组(P&<0.01)，复方组与雷公藤组能抑制足爪PGE2水平(P&<0.05)，复方组、祛风湿组、雷公藤组都能明显抑制关节滑膜TNF-α水平(P&<0.01)，低剂量复方组也能抑制关节滑膜TNF-α水平(P&<0.05)，造模组脾与胸腺的脏器指数有升高趋势(脾脏指数P&<0.05)。结论 中药复方配伍能抑制大鼠足爪PGE2、TNF-α水平，制川草乌合剂发挥主要作用。
【关键词】 佐剂性关节炎 中药复方 配伍规律 前列腺素E2 肿瘤坏死因子α 大鼠
Abstract：Objective To observe the effect of Chinese herbs most used in rheumatoid arthritis such as diaphoretics (ephedra)， wind-expelling herbs (monkshood)， blood activating drugs (angelica) and compound mixture in treating adjuvant arthritis， and study the compatibility law. Methods AA rats in groups were treated with ephedra-cinnamon twig mixture， monkshood-aconitum mixture， angelica- chuanxiong mixture， herbs compound mixture， low dose herbs compound mixture which is composed of above-mentioned herbs and semblable function herbs. Compare with normal group， model group， tripterygium wilfordii hook (TWH) group， TNF-α and PGE2 level of hindpaw were measured by ELISA and spectrophotometer. Weight index of immune organs were measured to study the effect of different functional ingredient groups and complex on immune function. Result The hinderpaw PGE2 level and TNF-α level of model group was higher than normal group (P&<0.01). Herbs compound mixture and TWH could inhibit the hinderpaw PGE2 level (P&<0.05). Herbs compound mixture， wind-expelling herbs and TWH could obviously inhibit the hinderpaw TNF-α level (P&<0.01). Low dose herbs compound mixture could also inhibit the hinderpaw TNF-α level (P&<0.05). The weight index of spleen and thymus of the model group showed a tendency to increase (spleen weight index P&<0.05). Conclusion The Chinese herbs compound can inhibit PGE2 and TNF-α level of hindpaw in rats， wind-expelling herbs play primary roles in the compound mixture.
Key words：adjuvant arthritis；herbs compound；compatibility law；PGE2；TNF-α；rat
中医对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的治疗积累了丰富的临床经验，但系统性、科学性不足。有文献报道[1]，1980－2002年，省级以上刊物收集治疗类风湿性关节炎的中药复方有300多首，归纳分析，祛风除湿、活血解表是该类复方常用的配伍规律。为探讨中药治疗RA的配伍规律，我们选取临床使用频率最高的解表药(麻黄)、祛风湿药(川乌)、活血药(当归)作为研究对象，并将上述药物配伍成药对，即：解表组(麻黄-桂枝组合)、祛风湿组(川乌-草乌组合)、活血组(当归-川芎组合)、复方组(上述药物配伍而成)。通过给佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis，AA)的Wistar大鼠灌胃不同的药对组合或复方，观察大鼠足爪前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平以及对免疫器官脾、胸腺的影响，分析作用效果及发挥主药作用的药对组合[2]。
1 材料与方法
1.1 动物
雄性Wistar大鼠80只，体重(200±20)g，山东大学实验动物中心提供。
1.2 药物
中药合剂：麻黄、桂枝、制川乌、制草乌、当归、川芎购自莱阳市江波大药房，山东中医药高等专科学校中药鉴定教研室鉴定全部合格。解表组麻黄与桂枝、祛风湿组制川乌与制草乌分别按1∶1组合，活血组当归与川芎按3∶2组合。将3个药物组按1∶1∶1比例组成复方合剂。各组合剂水煎液在山东中医药高等专科学校药剂实验室完成。雷公藤多甙片，10 mg/片，购自浙江得恩德制药有限公司，批号Z33020422。
1.3 仪器与试剂
Thermo Multiskan MK3酶标仪(北京惠安泽泰科技有限公司)、TU-1900紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、光学显微镜、电子天平。弗氏不完全佐剂(美国Sigma公司产品)；肿瘤坏死因子试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司产品)；卡介苗(北京生物制品研究所)。
1.4 方法
1.4.1 动物模型的制作
将卡介苗80 ℃ 1 h灭活后，与弗氏不完全佐剂配成卡介苗浓度为10 g/L的乳剂，充分碾磨混匀，即得弗氏完全佐剂(FCA)，于每鼠右后足跖皮内注射0.1 mL致炎。
1.4.2 分组与给药
将80只大鼠用随机数字法分为8组：正常对照组、模型组、雷公藤组、复方组、低剂量复方组、祛风湿组、解表组、活血组，每组10只。从致炎开始给药，正常组给予灌胃蒸馏水4 mL/d；模型组灌胃等量蒸馏水；雷公藤组灌胃雷公藤悬浊液40 mg/(kg·d)；祛风湿组灌胃川草乌合剂2.7 g/(kg·d)；活血组灌胃归芎合剂10.5 g/(kg·d)；解表组灌胃麻桂合剂8 g/(kg·d)；复方组灌胃复方合剂21.2 g/kg (以上各组给药量均为70 kg体重人用量的5倍)，低剂量复方组灌胃半量复方合剂10.6 g/kg。给药时间均为25 d。
1.4.3 足爪前列腺素E2的检测[3]
致炎后25 d脱臼处死大鼠，在踝关节上0.5 cm处剪下炎性足爪，称重，剪碎组织，生理盐水5 mL，浸泡24 h，离心浸泡液，吸取上清液0.2 mL，加入0.5 mL/L KOH-甲醇溶液2 mL，在50 ℃下异构化2O min，用甲醇稀释至10 mL，于278 nm波长处测定其光密度(A)值。结果以每克炎性组织相当的吸光密度值表示PGE2的含量。
1.4.4 肿瘤坏死因子α的检测
取大鼠足爪同上，其余步骤按试剂盒说明书步骤操作完成。
1.4.5 免疫脏器的检测
于实验第25日处死大鼠后取脾脏、胸腺后称脏器湿重，计算脏器指数(脏器湿重/动物体重×100%)。
1.4.6 统计学方法
计量资料以—x±s表示。各参数的比较使用SAS9.0统计软件，程序检验各组间差异显著性，组间比较采用dunnett检验。
2 结果
2.1 一般情况
造模后第2日，除正常组外，所有大鼠出现造模局部(原发侧)红肿，伴皮温升高，精神萎靡，食欲减退，体重减轻，皮毛颜色暗淡。造模12 d，大鼠在不同程度上出现对侧后肢继发性肿胀，少数前肢也出现继发性肿胀，耳朵出现结节。
2.2 各中药组对佐剂性关节炎大鼠前列腺素E2的影响
致炎后第25日，利用分光光度法检测局部足爪PGE2的含量。结果见表1。
2.3 各中药组对佐剂性关节炎大鼠肿瘤坏死因子α的影响
致炎后25 d采用ELISA法检测足爪中TNF-α水平，结果发现：各治疗组TNF-α均高于正常组，模型组TNF-α水平远远高于正常(P&<0.01)，雷公藤组、复方组、祛风湿组TNF-α水平又明显低于模型组(P&<0.01)。结果见表1。表1 各中药组对AA大鼠足爪PGE2及TNF-α的影响(略)注：与模型组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与正常组比较，▲P&<0.05，▲▲P&<0.01(下同)
2.4 各中药组对佐剂性关节炎大鼠免疫脏器的影响
造模后各组脾脏指数均有高于正常组的趋势，说明造模后大鼠免疫功能紊乱，其中模型组与低剂量复方组脾脏指数升高明显(P&<0.05)，造模后各组胸腺指数与正常组比较有升高趋势，但差异不够明显(P&>0.05)。结果见表2。表2 各中药组对AA大鼠免疫脏器的影响(略)
3 讨论
RA是一种以关节滑膜炎症为主要病理表现的慢性自身免疫性疾病，为临床常见病、多发病、难治病，致残率高。AA是常用来研究RA的动物模型，在本实验中，大鼠出现了与文献报道中相同的症状、体征、病理变化，并且AA大鼠足爪中TNF-α、PGE2水平升高，说明造模成功[4]。
炎性细胞因子TNF-α在RA的发生机理中起着重要作用。能促进胶原酶、PGE2等多种炎症介质的释放，并趋化、吸引炎性细胞进入关节滑膜，介导关节滑膜发生持久的炎症反应，诱导成纤维细胞增殖分化，介导增生和血管翳形成，致关节软骨和骨质破坏，关节强直。
本实验结果显示：中药复方合剂在低剂量组就有明显抑制TNF-α水平的作用，高剂量组的作用效果更明显，说明中药复方合剂对AA大鼠足爪的TNF-α水平有重要的影响作用。祛风湿组的制川草乌合剂对TNF-α的抑制作用也较明显，与复方组的水平无差异，可以推测，制川乌、草乌在中药复方合剂中是发挥主要作用的药物。麻桂合剂虽然具有一定的抗炎作用，但从文献[5]可以看出，剂量要大。归芎合剂抑制TNF-α水平的作用效果也不明显。
PGE2是具有广泛生物学活性的细胞因子，近年来的研究表明，它参与RA的病理生理过程。从本实验结果看，中药复方合剂对PGE2抑制明显，比单方组有增效作用。麻桂合剂、制川草乌合剂、归芎合剂对PGE2都没有明显的抑制作用，但制川草乌合剂PGE2水平较其它组低，有可能在复方组发挥作用更大一些。
Wistar大鼠造模后，其免疫器官有增大的趋势，说明AA大鼠免疫功能紊乱，而复方组、祛风湿组、解表组AA大鼠的免疫器官有恢复正常的趋势，说明中药复方合剂、制川草乌合剂、麻桂合剂具有调节免疫的功能。其中麻桂合剂效果更明显。
祛风除湿、活血解表是中药复方治疗RA常用的配伍规律，通过实验观察，以此配伍规律组成的中药复方合剂对AA大鼠足爪的TNF-α、PGE2水平均有较明显的抑制作用，其中，制川草乌合剂可能在复方中发挥主要作用，麻桂合剂调节免疫作用更明显。总之，中药复方治疗RA的配伍规律还有待于深入研究分析。
参考文献
[1] 周 鲁，宋 航，曾琳琳，等.中药复方治疗类风湿性关节炎的用药规律研究[J].四川中医，2004，22(13)：23－24.
[2] 李晋奇，彭 成.制川乌配伍白芍的增效作用及其作用机理[J].华西药学杂志，2007，22(2)：144－148.
[3] 张玲玲，魏 伟，严尚学，等.木瓜苷对小鼠胶原性关节炎的预防作用及初步机制[J].中国药理学通报，2004，20(1)：95－100.
[4] 李广清，汪 悦，夏卫军，等.痹痛灵拆方的正交t值法实验研究[J].中成药，2005，27(2)：95－100.
[5] 周 军，方素萍，齐 云，等.桂枝汤对大鼠佐剂性关节炎的防治作用研究[J].中药药理与临床，2000，16(6)：1－3