作者：沈丽霞 许惠玉 赵丕文 牛建昭 王继峰
【摘要】 ：目的 观察槲皮素(Quercetin，Que)对人类乳腺癌细胞株增殖的影响。方法 采用MTT法测定槲皮素对雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF-7和非雌激素依赖性乳腺癌细胞MDA-MB231细胞增殖作用，并以雌激素受体拮抗剂ICI 182、780为工具药来评价槲皮素发挥雌激素样作用与雌激素受体(ER)的关系，采用流式细胞术对MCF-7细胞的增殖情况进行分析。结果 与溶剂对照组相比较，Que(10～50 μmol/L)能显著促进MCF-7细胞的增殖，而抑制ER阴性MDA-MB231细胞，并将MCF-7细胞周期由G1期向S期推进，促进DNA合成，提高细胞分裂增殖指数，且Que促进MCF-7细胞增殖作用被ER拮抗剂所拮抗。结论 Que具有雌激素活性，此作用是通过ER介导的。
【关键词】 植物雌激素 槲皮素 雌激素受体 细胞增殖 MCF-7 MDA-MB231
Abstract：Objective To investigate the effects of quercetin on the proliferation of mammary cancer cell in vitro. Methods Effects of quercetin on the cell proliferation was tested in ER-positive MCF-7 cell and ER-negative MDA-MB231 cell by MTT measurement. And to evaluate the estrogen-like effect of quercetin and its relation with the estrogen-receptor by pure estrogen receptor antagonist ICI 182， 780 as a tool. Cell cycle was examined by flow cytometry. Result Quercetin (10～50 μmol/L) stimulated proliferation of ER-positive MCF-7 cell compared with solvent control， whereas ER-negative MDA-MB231 cell proliferation effect was inhibited， and the cell cycle was impulsed from G1 to S， DNA synthesizing was inhanced， PI was also increased. The above function on boosting MCF-7 cell proliferation can be inhibited by adding estrogen receptor antagonism ICI182， 780. Conclusion Quercetin has the estrogen-like activities through the estrogen response pathway.
Key words：phytoestrogen；quercetin；estrogen receptor；cell proliferation；MCF-7；MDA-MB231
绝经后妇女雌激素替代疗法的目的是控制绝经引起的症状，预防心血管疾病和骨质疏松，但由于其对子宫和乳腺的不良反应，限制了它的临床应用。为避免雌激素长期治疗的不良反应，植物雌激素(phytoestrogen，PE)引起了人们的广泛关注。PE是具有雌激素效能的天然化合物。已证实，PE对机体具有类雌激素和/或抗雌激素活性的双重作用。一方面，PE在体内能够与雌激素受体(ER)相结合，不同种类的PE与ER结合的亲合力不同而显示出不同的作用效能。当PE使用足够的剂量，它可以产生与体内17β-雌二醇(17β-estrodiol)相似的效能。人类可以从植物中获取该类化合物，发挥雌激素作用[1]。槲皮素(quercetin，Que)是植物界分布最广的黄酮类化合物之一，存在于多种中草药、蔬菜及水果中。Que与17β-雌二醇的结构相似，其对肿瘤的化学预防和治疗作用日益受到人们的关注，有抗乳腺癌等多种肿瘤的活性[2]，但其雌激素作用的研究国内尚未见报道。我们以往的实验还证实，菟丝子含药血清可使MCF-7细胞增殖显著加速，表现出雌激素样作用[3]，菟丝子的主要有效成分是Que。本实验通过观察不同浓度的Que对2种不同类的人乳腺癌细胞系(雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF-7和非雌激素依赖性乳腺癌细胞MDA-MB231)增殖作用的影响，探讨槲皮素是否是菟丝子发挥雌激素作用的活性成分，以及能否将其归入PE，为从中药中开发利用PE的新药源奠定理论基础。
1 实验材料
1.1 细胞系
人类乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB231，协和医科大学细胞中心提供。
1.2 药物与试剂
Que、雌二醇(E2)、MTT、二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。DMEM(高糖)、无酚红DMEM、活性炭-葡聚糖苷处理的胎牛血清(CDT-FBS)为Hyclone公司产品；胰蛋白酶为Gibco公司产品。
1.3 主要仪器
CO2培养箱(Binder制造)；酶联免疫检测仪(EQUENLX- 800)；倒置显微镜(Olympus)。
2 实验方法
2.1 细胞培养
MCF-7、MDA-MB231细胞采用开放式单层贴壁培养，培养液为DMEM(含10% 胎牛血清)，培养条件为37 ℃、5% CO2。试验开始前4 d将细胞用PBS洗涤后改为在无酚红DMEM(含5% CDT-FBS)中培养以耗尽细胞内储存的雌激素。
2.2 分组
将各Que试物用DMSO溶解后，以培养液稀释成所需浓度。溶剂对照组(DMSO组)：体积含量比为0.1%；雌激素对照组(E2组)：0.001 μmol/L；Que组：1、10、20、30、40、50 μmol/L。
2.3 MTT细胞增殖试验
MCF-7、MDA-MB231细胞经无酚红DMEM(含5%CDT-FBS)培养4 d后，选取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，0.01 μmol/L PBS(pH 7.4)洗2次，加入无血清DMEM，以每孔2×103个的浓度接种于96孔板内，每孔培养液总体积为200 μL。培养24 h待细胞贴壁后，换为含阳性药物(E2)及4种受试物的DMEM培养液继续培养，每种受试物设4个复孔。分别于24、48、72 h时，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续孵育4 h，小心吸去培养液，每孔加入DMSO 200 μL，震荡5～10 min，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶联免疫检测仪在570 nm下测定各孔光吸收值，计算平均A值和增殖率(PR)。
PR＝(实验组A值/溶剂对照组A值)×100%
2.4 雌激素受体完全拮抗实验
为验证受试物促MCF-7细胞的增殖是否通过ER发生作用，取经无酚红DMEM(含5%CDT-FBS)培养4 d后的MCF-7细胞，以每孔2×103个接种于96孔板。培养24 h待细胞贴壁后，换为含阳性药物(E2)及不同浓度药物的无酚红DMEM培养液，各孔同时分别加入终浓度为10-8 mol/L的雌激素受体完全拮抗剂ICI 182、780[4]，每种受试物设4个复孔。于24 h加入MTT，孵育4 h后吸去培养液，以DMSO溶解，在570 nm下测定各孔光吸收值，计算平均A值和增殖率。
2.5 细胞周期测定
取经无酚红DMEM(含5% CDT-FBS)培养4 d的MCF-7细胞，以5×105个/瓶的密度接种于96孔板中，以无血清DMEM接种24 h待细胞贴壁后，换为含阳性药物及不同浓度药物的DMEM培养液继续培养，每种受试物设3个复孔。48 h后终止培养，收获细胞用70%冷乙醇4 ℃固定过夜，RNase处理，PI染色，2 h内用流式细胞仪检测细胞周期分布，并计算细胞增殖指数(PI)。
PI＝(S＋G2M)/(G0/G1＋S＋G2M)×100%
2.6 统计学方法
实验数据用x±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行方差分析(one-way ANOVA)。
3 结果
(见表1～表4)表1 槲皮素对MCF-7细胞周期的影响(略)注：与DMSO组比较，*P&<0.05(下同)表2 槲皮素对MCF-7细胞增殖作用的影响(略)表3 槲皮素对MDA-MB231细胞增殖作用的影响(略)表4 槲皮素对雌激素受体拮抗剂ICI 182、780处理后的MCF-7细胞增殖作用的影响(略)
4 讨论
MCF-7细胞是ERα阳性的人乳腺癌细胞株，能特异性地受雌激素或雌激素样活性物质调节而增殖。MCF-7细胞雌激素样增殖试验非常灵敏，简便易行，还可区分激动剂和拮抗剂，因而被广泛应用于快速筛选和评价环境雌激素和PE [5-7]。本实验采用人乳腺癌ER阳性细胞系MCF-7细胞和ER阴性细胞系MDA-MB231进行细胞增殖研究，MTT增殖实验结果表明，与E2类似，Que在一定剂量范围内能促进ER阳性细胞系MCF-7增殖，且呈现出一定的剂量-效应关系，此作用与E2作用相同，但却抑制ER阴性细胞系MDA-MB231增殖，表明Que具有雌激素样作用。它们对细胞增殖周期的影响也与E2趋势相同，即显著提高细胞分裂增殖指数，主要表现在S期细胞比例显著增加，G2/M期细胞比例也有所上升。
植物成分发挥雌激素样作用往往是通过ER介导的[8-9]。ICI 182、780作为一种实验用雌激素受体完全拮抗剂，能完全阻断E2等雌激素样物质由ERs介导的一系列生物效应，包括促增殖作用[10]，故被选作工具药来探讨提取物雌激素样作用的机制。实验中Que与ER拮抗剂共孵育，发现诱导MCF-7细胞增殖作用能被ICI 182、780完全拮抗。在ICI 182、780存在时，其相对增殖率降至溶剂对照组的水平，此作用与阻断E2类似，提示其促MCF-7 细胞增殖作用是通过ER所介导的。
本实验采用体外细胞实验，通过检测Que与雌激素依赖性乳腺癌细胞增殖的关系，可以初步反映其雌激素样作用，为其药用价值的理论研究和实践应用提供了依据。具体如何通过ER介导影响细胞内信号转导通路以及基因表达还需要进一步的实验研究。
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