作者：赵彦青 王伟民 申亚晖 宋文翔
【摘要】 ：目的 观察扶正护脑胶囊对脑出血大鼠蓝斑和心肌组织去甲肾上腺素含量的影响。方法 动物随机分为假手术组、模型组、扶正护脑组和安宫牛黄组，分别于术后6、24、72 h 3个时相点取材，采用高效液相色谱-电化学检测法测定蓝斑和心肌组织去甲肾上腺素的含量。结果 术后各时间点蓝斑和心肌组织去甲肾上腺素的含量均显著升高，扶正护脑组和安宫牛黄组均能降低其含量。结论 扶正护脑胶囊通过抑制蓝斑-去甲肾上腺素系统的激活，减轻脑出血后心肌的损伤。
【关键词】 扶正护脑胶囊 去甲肾上腺素 蓝斑-去甲肾上腺素系统 大鼠
Abstract：Objective To observe the effect of Fuzhenghunao capsule on NE of the locus ceruleus and myocardial tissues in rats with intracerebral hemorrhage. Methods 72 rats were randomly pided into 4 groups：sham， model， Fuzhenghunao and Angongniuhuang. The content of NE were tested by the high performance liquid phase-electrochemical method at 6 h， 24 h and 72 h of post-operation. Result NE was obviously increased in sham group， and decreased in two treatment groups. Conclusion Fuzhenghunao capsule could be used to inhibit the activation of locus ceruleus noradrenalin system and protect myocardial tissues by regulating NE content.
Key words：Fuzhenghunao capsule；noradrenaline；locus ceruleus noradrenalin system；rat
去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)是与心血管活动密切相关的重要的神经递质，蓝斑核是重要的植物神经调节中枢之一，主要由含去甲肾上腺素能的神经元组成，是NE合成的主要部位，具有重要的心血管调节作用。扶正护脑胶囊是导师孙塑伦教授治疗中风急性期的经验方，具有补肾填精、补益脑髓、活血化瘀的功效。我们前期的工作观察了扶正护脑胶囊对脑出血大鼠血清肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白(cTnI)、心肌内皮素、血栓素(TXA2)和前列环素(PGI2)的影响[1-2]。本实验继续观察扶正护脑胶囊对脑出血大鼠心肌和蓝斑中NE含量的影响，进一步探讨扶正护脑胶囊抗脑出血后心肌损伤的机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，中国医学科学院动物中心提供。
1.2 主要仪器
Waters 510高效液相色谱系统、Waters 464电化学检测器(Waters公司)；WDL95-色谱工作站(中国科学院大连色谱中心)；Soniprep 150超声粉碎器；色谱柱为Resolve TMC18 (5 μm， 4.6 mm×150 mm)；流动相为50 mmol/L柠檬酸-乙酸钠缓冲液，pH3.5(0.6 mmol/L B-8离子对试剂，1.0 mmol/L二正丁胺，0.3 mmol/L Na2EDTA，2%甲醇)；台式高速离心机(军事医学科学院实验仪器厂)等。
1.3 主要药物与试剂
NE、内标物3，4-二羟苄胺(DHBA)为美国Sigma公司产品；正丁胺为上海试剂公司进口分装产品；B-8离子对试剂为天津化学试剂公司产品；扶正护脑胶囊系北京中医药大学东直门医院重点实验室中药化学组提供，0.5 g/粒；安宫牛黄丸系北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产，3 g/丸，批号6010103。甲醇(分析纯)为北京化工厂产品；其它试剂均为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 分组及给药
72只动物随机分为假手术组、模型组、扶正护脑组和安宫牛黄组，每组18只，分别于术后6、24、72 h 3个时相点取材，每个时相点6只动物。从术前11 d开始灌胃，扶正护脑组剂量为1.35 g/(kg?d)，安宫牛黄组剂量为0.27 g/(kg?d)，假手术组和模型组分别予等量的生理盐水。第12日造模，手术前后疗程2周。
2.2 大鼠脑出血动物模型的建立
参照文献[3]方法，即选用胶原酶加肝素联合注射建立脑出血动物模型。大鼠术前8 h禁食不禁水，用0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于脑立体定位仪上。取头皮正中切口，骨膜剥离器剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，取前囟为原点，向右3 mm、向后1 mm、深度5 mm为注射点即为右侧尾状核，牙科钻钻孔，微量注射器注射含胶原酶(1 U/μL)和肝素(7 U/μL)的生理盐水1 μL。假手术组注射等量生理盐水。注药后留针5 min，退针缝合头皮。
手术动物苏醒后，根据Bederson等[4]的评定方法分为3级。1级：将大鼠尾巴提起，瘫痪侧前肢回收后屈曲于腹下，正常侧前肢向地面伸展；2级：除1级体征外，向瘫痪侧推大鼠时阻力较对侧明显降低；3级：除以上体征外，大鼠有向瘫痪侧侧旋或倾倒的行为。符合以上症状和体征的显示造模成功。
2.3 组织样品的制备
冰盘上取蓝斑组织和左室壁心肌组织，称重，加入冰冷的0.1 mol高氯酸溶液(1 mg组织加20 μL)和25 μL DHBA(2 g/L)，冰浴条件下超声匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液进行分析。
2.4 检测指标及方法
采用高效液相色谱-电化学检测法(HPLC-ECD)测定NE的含量。
2.4.1 测定条件
色谱条件：Nova-Pak C18色谱柱，4.6 mm×150 mm，5 μm(大连色谱中心填装)，流动相为50 mmol/L，pH为3.5的柠檬酸-乙酸钠缓冲液(内含0.6 mmol/L B-8离子对试剂，1.0 mmol/L二正丁胺，0.3 mmol/L Na2EDTA，2%甲醇)，流速1.0 mL/min，玻璃碳工作电极，检测池电压为0.75 V；3，4-二羟苄胺DHBA为内标物，样品中各主要组分用内标法进行定量。
2.４.2 样品测定
取20 μL上清液，经0.5 μm滤膜过滤后上机检测，含量以ng/g组织湿重表示。
2.5 统计学方法
所有数据均以x±s表示，用SPSS12.0 统计分析软件处理。组间比较采用方差分析(One-Way ANOVA)，相关分析采用Pearson分析。
3 结果
(见表1、表2)表1 各组大鼠蓝斑组织中NE含量比较(略)注：与模型组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与假手术组比较，△P&<0.05，△△P&<0.01；与安宫牛黄组比较，#P&<0.05(下同) 表2 各组大鼠心肌组织中NE含量比较(略)
4 讨论
近年来研究证明，体内有一个应激系统介导应激反应的发生。当体内稳态受到干扰时，应激系统即活动起来。应激系统有两个主要组成成分[5]：一个是下丘脑室旁核中的促肾上腺皮质素释放素(corticotropin releasing hormone，CRH)神经元，另一个是位于脑干脑桥中部称为蓝斑(LC)的神经元。由蓝斑发出的是去甲肾上腺素能纤维，称之为蓝斑-去甲肾上腺素(LC-NE)。CRH是控制促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)释放的下丘脑激素。下丘脑室旁核的CRH神经元所发出的神经纤维向激发大脑皮质觉醒反应的上行激动系统投射。蓝斑主要由含去甲肾上腺素能的神经元组成，其发出的去甲肾上腺素纤维投射到下丘脑及大脑皮质。蓝斑是NE合成的主要部位，其上行神经纤维也是网状结构中上行激动系统的组成部分。蓝斑及其相关的NE能神经元在应激时经去甲肾上腺能神经元广泛的纤维上传至杏仁体、边缘皮质、新皮质致NE释放，引起相应的情绪反应；下传到脊髓侧角，调节交感神经及肾上腺髓质兴奋，进而引起血浆中E和NE浓度迅速上升，主要参与调控机体对应激的急性反应，介导一系列的代谢和心血管代偿机制以克服应激源对机体内环境的损害，如调节心律、外周血管阻力和抑制胰岛素分泌、刺激胰高血糖素的分泌等[6]。同时，脑干去甲肾上腺素能神经元与室旁核处的CRH神经元有直接的纤维联系，可能成为下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)反应启动的关键结构[7-8]。
在应激性心脏病中，交感神经-肾上腺髓质系统起着关键的作用。应激性心律失常和心肌坏死主要由交感神经兴奋和儿茶酚胺(catecholamine，CA)分泌增多引起。
关于单氨类递质在脑心综合征机制中发挥的作用文献报道较少。许氏等[9]观察了脑出血大鼠血浆NE的含量与血清CK-MB含量的动态变化，结果发现，术后二者均显著升高，术后24 h达到高峰，术后48 h开始下降，二者变化趋势基本一致。提示外周血NE的增加参与了脑出血后的心肌损伤。目前研究认为，血浆儿茶酚胺的升高更多来自心内神经末梢释放的增加而不是交感肾上腺活动的增强[10-11]。此外，外周血NE增加还与中枢神经元释放增加以及中枢神经系统单胺类递质神经元损伤、血脑屏障破坏、脑内NE弥散入血循环增多有关[12]。本实验从NE产生的中枢调控机制着手，检测蓝斑和心肌中NE含量的动态变化。实验结果表明，大鼠脑出血不同时间点蓝斑NE含量的变化规律与心肌中NE的变化规律一致，相关性分析结果也表明蓝斑和心肌组织中NE含量与心肌损伤程度密切相关。提示蓝斑在脑出血诱发心肌的损伤中起着非常重要的作用。
实验结果还表明，扶正护脑胶囊能降低LC和心肌组织NE含量，提示它可能通过抑制LC-NE系统的激活，减少NE的合成和(或)释放，从而改善心肌损伤。
参考文献
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