作者：黄清怡 孔繁飞 李莉 孔焕宇
【摘要】 ：目的 观察玉红膏对大鼠皮肤创面愈合修复中神经肽P物质(Substance P，SP)的影响，探讨玉红膏促进创面愈合修复的作用机理。方法 取144只大鼠于背部造成直径1.8 cm全层皮肤缺损模型，完全随机法分成3组，即玉红膏组、京万红组、模型组，另设正常对照组。于造模后第1、3、5、7、10、14、21、30天8个时间点进行创面愈合率、组织形态、SP免疫组化染色的观察和检测。结果 与模型组比较，玉红膏组的创面愈合率提高(P&<0.05)，形态学显示创面中性粒细胞浸润较少，增生期新生血管、成纤维细胞和胶原纤维数量较多；创面中SP表达在创伤后3、5、7、10、14 d高于模型组(P&<0.01，P&<0.05)。结论 玉红膏有促进创面愈合的作用，机理与在增生期促进创面SP分泌有关。
【关键词】 玉红膏 创面愈合 神经肽P物质 大鼠
Abstract：Objective To observe the effect of Yuhong ointment on secretion of Substance P of promoting wound healing and explore its mechanism. Methods The whole layer skin defection rat was used and randomly pided into 3 groups：Yuhong ointment group， Jingwanhong group， model group， with normal rats as control. The condition of skin wound surface and healing time were observed and recorded at 1， 3， 5， 7， 10，14， 21， 30 day after wound. The expression of Substance P were measured and compared by immunohistochemistry staining. Results Average wound healing rate had no significant difference between Yuhong ointment group and Jingwanhong group， which were higher than model group (P&<0.05). The results of immunohistochemistry staining illustrate the Substance P secretion of Yuhonggao group was more than that of model group in the 3th， 5th， 7th， 10th， 14th day (P&<0.01， P&<0.05). Conclusion Yuhong ointment can accelerate skin wound healing and maybe related with promoting the secretion of Substance P of skin wound in the proliferation period.
Key words：Yuhong ointment；wound healing；Substance P；rat
近年研究表明，皮肤创伤愈合时，受损组织通过释放包括神经肽P物质(Substance P，SP)在内的介质，参与伤口愈合的调控。本实验利用免疫组化染色技术，观察SP在大鼠各组的表达差异，以探讨玉红膏促进皮肤创面愈合修复的部分机理。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级健康Wistar雄性成年大鼠，体重180～210 g，中国中医科学院基础理论研究所实验动物中心提供，动物合格证号为SBSCXK(京)2002-2006。
1.2 主要药物、试剂及仪器
玉红膏，购自中国中医科学院广安门医院制剂中心，批号20020110；京万红，天津达仁堂达二药业有限公司产品，批号Z12020440。SP多克隆抗体，即用型SABC免疫组化试剂盒、lot50581654、DAB显色试剂盒、lot50281313均为北京中杉金桥生物工程有限公司产品。生物组织制动脱水机，天津爱华；Olympus光学显微镜；Image-Pro-Plus彩色病理图像分析系统。
2 实验方法
2.1 分组
将144只大鼠按完全随机法分成3组，即玉红膏组、京万红组、模型组，每组48只动物，另设6只为正常对照。
2.2 造模与给药
正常对照组常规饲养，不作任何处理，其余各组造模。大鼠致伤前1 d背部剃毛，24 h后腹腔注射0.3%戊巴比妥钠10 mL/kg麻醉，背部用75%酒精消毒后，在每只鼠背部剪3个直径1.8 cm的圆形全层皮肤缺损创面。玉红膏组造模后立即外敷玉红膏，每个创面0.1 g；京万红组造模后立即外敷京万红，每个创面0.1 g；2组均每日定时换药2次至创面愈合；模型组创面不予处理。使用无菌垫料单笼喂养。
2.3 取材和组织处理
于造模后第1、3、5、7、10、14、21、30天观察记录创面愈合情况并取材，每组每个时间点6只动物。大鼠在麻醉状态下，剪取创面皮缘约(2×2)cm2，取材后用4%多聚甲醛固定液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片。按说明书操作步骤进行HE常规染色和SP的免疫组化染色，一抗效价1∶100，以PBS代替一抗作阴性对照。
2.4 检测指标与方法
2.4.1 创面愈合率
比较玉红膏组、京万红组、模型组间创面愈合率，创面愈合率＝(原始创面面积－未愈合创面面积)/原始创面面积×100%。
2.4.2 病理形态学观测
观察各组创面愈合过程中的病理形态学变化，比较玉红膏组与模型组的创面愈合特点。
2.4.3 免疫组化测定
用Olympus光学显微镜观察SP的表达情况，胞浆或间质棕黄色颗粒者为阳性表达，用Image- pro-plus图像分析系统分析软件，测定距创面中心0.6 cm范围内的真皮及表皮SP阳性面积。
2.5 统计学方法
所有计量数据以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件对组间计量资料进行方差分析。
3 结果
3.1 各组创面愈合率比较
(见表1)表1 各组大鼠不同时点全层皮肤缺损创面的创面愈合率比较(略)注：与模型组比较，*P&<0.05
3.2 玉红膏组与模型组HE形态学特点比较
与模型组比较，玉红膏组创面中性粒细胞浸润较少，可见在增生期，新生血管数量较多，与创面垂直生长，且管径较粗；成纤维细胞数量较多，胞体较大，胞浆突出明显，核仁染色较深，胶原纤维较多。重塑期胶原纤维排列比模型组有序。
3.3 各组神经肽P物质阳性表达比较
(见表2)表2 各组大鼠不同时点创面中SP阳性表达比较(略)注：与模型组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与京万红组比较，▲P&<0.05
4 讨论
现代医学认为，皮肤创面愈合过程通常分为炎症期、增生期和重塑期[1]。SP作为一种具有多方面生理学效应的神经肽，参与皮肤创面愈合的全过程［2］。脊髓和组织神经末梢以及皮肤的角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和肥大细胞等均能分泌释放神经肽。在创伤修复中它的主要作用有：①参与早期的神经源性炎性反应而促进创口愈合，主要通过刺激内皮细胞收缩、血管平滑肌细胞舒张，促进血管扩张并使其渗透性增加[3]；②能够增强微血管的形成，其主要的作用机制可能是通过内皮细胞的增殖作用完成；③通过与SP受体结合作用于成纤维细胞，促进成纤维细胞的趋化移行和增殖；④以直接作用或协同的方式诱导单核巨噬细胞系统释放某些细胞因子，在这些因子的介导下引起成纤维细胞迁移、趋化和增殖，从而大量合成分泌胶原及其它细胞外基质成分，促进结缔组织增生，及时修复创伤；⑤促进皮肤神经纤维的生长，伤口中的神经肽活性细胞可刺激组织产生多种因子而间接引起神经因子的分泌。
本实验结果显示，玉红膏可促进创面愈合过程中增生期SP的表达，因而玉红膏促进创面愈合修复的机理之一有可能与SP在创面愈合增生期分泌增多有关。
伤后第3天，玉红膏组SP表达迅速上升，显著高于其它2组，经苏木素复染显示SP主要位于细胞内，大部分细胞形态上多呈椭圆型，胞核正圆，位于中央，SP在胞浆内多呈典型颗粒样分布；从位置上判断这些细胞多位于血管附近，推测可能为肥大细胞；由此推断，在创伤早期，玉红膏以促进血源性SP的分泌为主。Walsh等[4]研究发现，伤后4～14 d是微血管形成最密集的时刻。本实验显示，增生期玉红膏组新生血管数量较多。玉红膏的活血化瘀作用与SP是否有关联，能否通过SP加速毛细血管再生，改善创面的血液循环，这些有待进一步研究分析。
SP虽然能加快创面的愈合，但诸多研究表明它在增生性瘢痕中含量明显高于正常瘢痕组织[5-6]，过高的SP分泌被认为是引起增生性瘢痕的一个重要因素。在实验中我们观察到，伤后第21天各组的SP表达都逐渐下降，第30天时玉红膏组SP表达明显低于模型组。那么，在创面到达重塑阶段后，玉红膏又是怎样影响创面重塑的，其机理还有待进一步探讨。
参考文献
[1] 张学军.现代皮肤病学基础[M].北京：人民卫生出版社，2001.5.
[2] Frode-saleh TS， Calixto JB， Mederios YS. Analysis of the inflammatory response induced by substance P in the mouse pleural cavity[J].Peptides，1999，20：259－265.
[3] Dunnick CA，Gibran NS，Heimbach DM.Substance P has a role in neurogenic mediation of human burn wound healing[J].J Burn Care Rehabil，1996，17(5)：390－396.
[4] Walsh DA，Hu DE，Mapp PI，et al.Innervation and neurokininreceptors during angiogenesis in the ratsponge granuloma[J].Histochem J，
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[5] 丛 林，李世荣，徐友奇.增生瘫痕P物质含量的放射免疫测定[J].中华整形烧伤外科杂志，1998，4(6)：401－403.
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