作者：陈小军 顾立刚 李佩文 石太平 马大龙
【摘要】 ：目的 观察中药榄香烯乳对人宫颈癌Hela细胞转录因子ELK1及其靶基因的影响，以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法 用MTT法检测药物对细胞的抑制作用，双荧光素酶报告系统检测药物对转录因子ELK1的影响，Western Blot检测磷酸化ELK1及其靶基因c-fos表达。结果 榄香烯乳能明显抑制人宫颈癌Hela细胞的生长，其半数生长抑制剂量为80.6 μg/mL；榄香烯乳处理组荧光素酶活性下降，磷酸化的ELK1及其靶基因c-fos的表达均下调。结论 榄香烯乳可能通过下调转录因子ELK1的磷酸化水平，抑制c-fos的表达，从而抑制人宫颈癌Hela细胞的生长。
【关键词】 榄香烯乳 Hela细胞 ELK1
Abstract：Objective To study the effect of elemene on transcription factor ELK1 and its target gene in human cervix cancer Hela cell. Methods The cell proliferation was assessed by MTT assay. The luciferase activity of transcription factor ELK1 was determined by the Dual-Luciferase Reporter Assay System. The protein expression of phosphorated ELK1 and its target gene c-fos were determined by Western Blot. Results Elemene can remarkably inhibited the growth of Hela cell and its IC50 was 80.6 μg/mL. The luciferase activity of transcription factor ELK1 in Hela cells treated with elemene was inhibited. The protein expression of phosphorated ELK1 and its target gene c-fos in Hela cells treated with elemene were down-regulated. Conclusion Elemene can inhibit human cervix cancer Hela cell proliferation， which may be related with suppression of c-fos gene through inhibiting expression of phosphorated ELK1.
Key words：elemene；Hela cell；ELK1
榄香烯乳是从中药温莪术挥发油中分离出来的油状物单体，已证明具有多种抗癌效应[1-3]，属国家二类抗癌新药。前期研究发现，榄香烯乳对人宫颈癌Hela细胞的体外增殖有明显的抑制作用[3]，但其内在机制尚不清楚。为此，本研究采用榄香烯乳处理人宫颈癌Hela细胞，观察了对细胞转录因子ELK1及其靶基因c-fos表达的影响。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
榄香烯乳，大连金港制药有限公司产品。人宫颈癌Hela细胞株，国家人类基因组北方研究中心功能基因组Ш细胞库提供。胎牛血清、DMEM均为Hyclone公司产品。MTT、双荧光素酶试剂盒和报告基因pFA2-ELK1均为Promega产品。高效真核转染试剂盒为威格拉斯仪器有限公司产品。抗P-ELK1为Cell Signaling公司产品。抗c-fos和抗β-Actin为Santa Cruz公司产品。
1.2 细胞培养
将人宫颈癌Hela细胞以含10%胎牛血清的DMEM在37 ℃、5% CO2孵箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。
1.3 细胞增殖抑制实验
取对数生长期的Hela细胞接种于96孔培养板(细胞数为5×104/孔，100 μL/孔)，加入不同浓度的榄香烯乳，使其终浓度分别为0、20、40、80、160、320 μg/mL，37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h后每孔加入MTT溶液15 μL，继续培养4 h后每孔加入裂解终止液100 μL，37 ℃、5% CO2孵箱中培养1 h，酶联检测仪570 nm波长处测定吸收度A值，并求其IC50值。
1.4 质粒转染
人宫颈癌Hela细胞以1×104/孔接种于96孔培养板，24 h后根据高效真核转染试剂盒说明书进行转染。将报告基因质粒pFA2-ELK1和内参质粒pRL-TK共转染入上述细胞培养孔中，三复孔，重复3次。
1.5 双荧光素酶活性测定
6 h后加入IC50浓度的榄香烯乳，37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h后，加入刺激剂PMA＋Ionomycin，于37 ℃孵箱中继续培养6 h后，收集细胞，加入1×PLB裂解液处理细胞后，用双萤光素酶试剂盒测定荧光素酶活性。
1.6 Western Blot检测磷酸化ELK1及其靶基因c-fos的表达
收集IC50浓度的榄香烯乳作用24 h的Hela细胞，加入蛋白抽提液，孵育、离心后BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。经5%和10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜。通过Western Blot检测试剂盒及ECL发光检测试剂盒，在暗室中使X线片曝光。结果以β-Actin为对照，观察蛋白表达水平。
1.7 统计学方法
定量数据以—x±s表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析。
2 结果
2.1 榄香烯乳对Hela细胞增殖的抑制作用
榄香烯乳20～320 μg/mL作用24 h对Hela细胞体外增殖有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性(见表1)，求其IC50值为80.6 μg/mL(0.08 mg/mL)。
表1 榄香烯乳对Hela细胞增殖的抑制作用(略)
2.2 榄香烯乳对Hela细胞ELK1荧光素酶活性的影响
IC50浓度的榄香烯乳处理24 h后，通过双荧光素酶报告系统检测发现，与对照组比较，处理组ELK1活性明显受到抑制。
2.3 榄香烯乳对Hela细胞磷酸化ELK1及其靶基因c-fos表达的影响
磷酸化的ELK1及其靶基因c-fos在Hela细胞中稳定高表达，以IC50浓度的榄香烯乳处理24 h后，通过Western Blot检测发现，磷酸化的ELK1及其靶基因c-fos的表达均下调(见图1)。
3 讨论
榄香烯乳是国家二类抗癌新药，前期研究发现，其对多种肿瘤有明显的抑制作用[1-3]，但其内在机制尚不清楚。本实验在以往报道基础上，以人宫颈癌Hela细胞为模型，采用MTT法进行研究，结果发现，榄香烯乳对Hela细胞体外增殖有明显的抑制作用，呈剂量依赖性，且有较高的IC50值(80.6 μg/mL)。
转录因子ELK1属于ETS癌基因家族成员，与细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤发生相关，是c-fos原癌基因的调节因子，其C端转录激活域的磷酸化与原癌基因c-fos的激活密切相关[4-6]。转录因子ELK1的磷酸化可能是恶性肿瘤发生发展的重要环节及细胞侵袭转移的调控通路[7]。外界刺激经一系列MAPK信号通路磷酸化ELK1，引起ELK1构象改变，从而增强其DNA结合活性，激活转录活性，上调生长分化相关基因，抑制凋亡相关基因，因而已成为肿瘤基因治疗中的一个新靶点。所以，探讨其相关调控机制，将有助于宫颈癌等肿瘤的基因治疗。
为了进一步了解榄香烯乳的抗癌机制，本研究采用双荧光素酶报告系统、Western Blot等方法进行研究，结果发现，人宫颈癌Hela细胞经IC50浓度的榄香烯乳处理24 h后，与对照组比较，荧光素酶活性下降，磷酸化的ELK1及其靶基因c-fos的表达均下调。由此提示，榄香烯乳抑制人宫颈癌Hela细胞生长的机制之一是下调了转录因子ELK1的磷酸化水平及其靶基因c-fos的表达。
综上所述，榄香烯乳能抑制人宫颈癌Hela细胞的生长，下调转录因子ELK1的磷酸化水平，抑制c-fos的表达，其具体的调控机制值得深入研究。
【参考文献
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