关于亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与低出生体重关系

　　　　 作者：吴涤 李静 杨艳芳 关明杰 王琨 秦荣

【摘要】 目的 探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与新生儿低出生体重的关系。 方法 采用病例对照研究方法，收集108例正常体重儿和57例低出生体重儿和母亲的流行病学资料及母亲的静脉血标本，用PCRRFLP方法分析母亲MTHFR基因型，采用 Iogistic回归法分析母亲MTHFR基因型与新生儿出生体重的关系。 结果 调整主要混杂因素后，未发现MTHFR CT/TT基因型与低出生体重之间存在统计学关联(OR=1.13，95 % CI： 0.61～1.78 )。 结论 母亲 MTHFR基因多态性与低出生体重不存在统计学关联。

【关键词】 亚甲基四氢叶酸还原酶;多态性;基因;低出生体重

　　【Abstract】 Objective To investigate the association between genetic polymorophisms of the methylenetetrahydrofolate reductase gene (MTHFR) in mother and low birth weight in the newborn.Methods A casecontrol design was used. Fiftyseven newborns with low birth weight were recruited as the case groups， and 108 newborn with normal birth weight as the control group. A facetoface questionnaire was administered to collect demographic and relevant information. Blood samples were collected from mothers of both groups. PCRRFLP method was applied to examine MTHFR polymorphisms. Logistic regression was used to analyze the association between genetic polymorphisms of MTHFR gene in the mother and low birth weight in the newborn， while controlling for potential confounding factors. Results After adjustment for the main confounding factors， no statistical association was not found between MTHFR CT / TT genotype and low birth weight (OR=1.13， 95 %CI: 0.61  1.78). Conclusion No statistical association between genetic polymorphisms of MTHFR gene and low birth weight was noted in this population.

　　【Key words】 Methylenetetrahydrofolate reductase; Polymorphism; Gene; Low birth weight

　　低出生体重作为早产、宫内发育迟缓、或二者兼有的表现结果，是新生儿死亡的主要因素之一 ，中国低出生体重儿发生率为活产婴儿的 5.87 %[1]。低出生体重的发生存在很大的个体差异，但人们对导致这些差异的因素却知之甚少。许多环境因素被证明与低出生体重有关，但这些环境因素仅能解释极小的一部分差异。大量证据表明，低出生体重的发生是由遗传和环境因素共同作用的结果。有研究报道，先天性蛋氨酸同型半胱氨酸(methionine homocysteine，MetHcy)代谢异常引起的血管病变可导致胎儿宫内发育迟缓[2]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)为同型半胱氨酸(homocysteine， Hcy)代谢途径的关键酶，MTHFR基因突变可使酶活性下降，造成血中Hcy增高。本研究通过检测母亲MTHFR基因多态性，探讨该基因突变与新生儿出生体重的关系，为低出生体重发生机制研究提供科学依据。

　　对象与方法

　　一、对象

　　2003～2006年在包钢集团第三职工医院住院分娩的108例正常体重儿(正常组)和57例低出生体重儿(低出生体重组)及其母亲。低出生体重儿的入选标准：(1)孕周&>28周，体重&<2 500 g;(2)正常分娩，剔除意外情况引起的早产儿;(3)剔除双胎或多胎、先天畸形儿。正常体重儿入选标准：选择同一医院出生的孕周≥28周、体重≥2 500 g、出生时间相差 &<7 d、单胎正常活产婴儿;2组剔除妊娠期有合并症及并发症孕妇和新生儿。

　　二、方法

　　1.问卷调查：项目课题组成员根据文献检索结果，考虑影响出生体重的相关因素设计调查问卷。采用统一问卷调查表，由经培训的调查员对每个孕妇进行面对面询问调查，获得详细社会人口学资料，同时询问母亲怀孕期间情绪、紧张程度、多梦、失眠状况、家人关照程度及怀孕期间每天使用计算机时间、看电视时间等自我感觉和行为因素。根据产房病例记录新生儿出生孕周、出生体重。母亲体重和血压为孕前健康体检时所检测结果。

　　2.血样收集及DNA提取：用EDTA抗凝管经无菌操作取母亲外周血2 ml，4 ℃保存， 24 h内按标准法[ 3 ]提取基因组DNA。

　　3.基因型检测:(1)MTHFR(C677T)。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction， PCR)扩增引物5’CAAAGGCCACCCCGAAGC3’5’AGGACGGTGCGGTGAGAGTG3’(引物由上海生物工程公司合成)。12.5 μl PCR反应体系中含有10×Buffer (Mg2+ 15 mmol/L )1.25 μl， dNTP ( 0.2 mmol/L)0.25 μl，上游引物 (5 μmol/L)0.1 μl，下游引物 (5 μmol/L)0.1μl，基因组 DNA 2.0 μl， Taq DNA聚合酶 (2 MU/L) 0.5 μl，灭菌双蒸水 8.3 μl。反应条件为94 ℃ 、5 min，94 ℃、45 s，62 ℃、40 s，72 ℃、45 s，扩增35个循环，最后72℃延伸7 min。PCR扩增产物245 bpDNA片段。(2)限制性内切酶消化。PCR扩增产物10 μl，酶切缓冲液2 μl，无菌去离子水7. 5 μl，HinfI限制性内切酶5 U，37 ℃水浴酶切6 h，2 %琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色(TaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、Marker、购自大连TaKaRa宝生物公司，琼脂糖等试剂购自上海生物工程公司)。CC基因型显示245 bp片段;CT基因型显示245 bp、175 bp、70 bp 3条片段;TT基因型显示175 bp和70 bp 2条片段。

　　4. 统计学处理：用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。根据等位基因的频率，用χ2检验对MTHFR基因型分布进行遗传平衡检验。用多因素Iogistic回归分析母亲MTHFR基因型与新生儿出生体重的关系，并调整身高、体重、文化程度、健康状况、收缩压、舒张压、分娩孕周、情绪、失眠、多梦、紧张、使用计算机时间、看电视时间及家人关照程度14个对出生体重可能产生影响的因素。

　　结 果

　　一、2组母亲及新生儿生理因素比较

　　低出生体重组母亲收缩压、舒张压、心率、首次月经年龄(简称月经首龄)高于正常组，睡眠时间长于正常组，分娩孕周和新生儿体重低于正常组，差异均有统计学意义(P&<0.05)，见表1。表1 2组母亲及新生儿生理因素比较

　　二、2组母亲社会和行为因素比较

　　低出生体重组初中以下文化程度比例高于正常组，每天看电视时间少于1 h者高于正常组，心情愉快的比例低于正常组，有时失眠的比例高于正常组，差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　三、母亲MTHFR基因多态性与低出生体重关系

　　MTHFR基因型分布，108例正常体重组母亲中，MTHFR基因CC型为48.1 %(52/108)，CT/TT型为51.9 %(56/108)，57例低出生体重儿母亲中，MTHFR基因CC型为45.6 %(26/57)，CT/TT型为54.4 %(31/57)，2组构成比差异无统计学意义(χ2=0.75，P&>0.05)，符合HardyWeinberg平衡。表2 2组母亲社会和行为因素比较 [例(%)]

　　四、母亲MTHFR基因多态性与低出生体重关系

　　单因素分析，57例低出生体重儿母亲与108例正常体重组母亲MTHFR基因第677位点CT/TT基因型与CC基因型相比，未发现MTHFR基因CT/TT基因型与新生儿低出生体重发生危险之间存在统计学关联(P=0.75，OR=0.90，95 %CI：0.49～1.68) ;将单因素分析有统计学意义的变量进入多因素Logistic回归模型中，以出生体重作为因变量，MTHFR(C677T)CT/TT基因型作为自变量，调整母亲身高、体重、文化程度、健康状况、收缩压、舒张压、分娩孕周、情绪、失眠、多梦、紧张、使用计算机时间、看电视时间及家人关照程度14个变量后，未发现MTHFR基因CT/TT基因型与新生儿低出生体重发生危险之间存在统计学关联(P=0.52，OR=1.13，95 % CI：0.61～1.78)。

　　讨 论

　　分娩代表胎儿在宫内生长发育的终点，它受母亲、胎盘、胎儿和一系列生物和环境因素的影响。以往对低出生体重的遗传影响因素研究相对较少。有证据表明，出生体重受遗传和环境因素的影响。在同胞之间出生体重的相关系数为0.36至0.62(中位数约为0.5)[4]。有人观察到低出生体重存在着代与代之间的遗传，说明遗传因素在低出生体重的发生中起一定作用。

　　MTHFR基因定位于染色体1p36.3上[5]，可将体内5，10亚甲基四氢叶酸还原为5甲基四氢叶酸，成为体内叶酸的主要活性形式。目前认为MTHFR基因第4外显子的C677T 碱基突变最为常见，该位点突变使高度保守的丙氨酸转变成缬氨酸，使MTHFR活性降低50 %，并产生不可耐热性，从而引起Hcy在血浆中的蓄积导致高Hcy血症[6]。Cris等[7]研究显示，在8～9孕周，当Hcy为15 μmol/L时，自然流产的发生率增加7倍; Hcy为10 μmol/L时，胎死宫内的危险性增加2倍。高Hcy导致绒毛膜血管形成缺陷，致使流产容易发生。妊娠期高Hcy可增加母亲血栓形成的危险性，引起胎盘血栓栓塞，从而引发流产。高Hcy使细胞处于高氧化应激状态从而具有胚胎毒性作用，致使胚胎发育异常或迟缓，引起新生儿出生体重减轻。

　　陈大方等[8]研究结果显示，婴儿MTHFR CT和TT基因型不但增加早产发生的危险性，而且能够增加低出生体重发生的危险。但母亲MTHFR 基因对早产和低出生体重的影响均没有统计学意义。本研究所得结果与之一致。钟秋安等[9]研究得到相同结果，显示母亲MTHFR基因突变型、对低出生体重影响无统计学意义(P&>0.05) ， 但MTHFR基因突变型与CBS基因突变型对低出生体重的影响存在交互作用。其能增加子代低出生体重发生的危险。

　　尽管高Hcy血症亦会在胎儿血液循环中有所表现，从而能引起胎儿心血管发育异常、神经管发育异常、早产等结果，这可能会导致胎儿出生体重的降低。但本研究结果未显示MTHFR基因多态性与出生体重之间的统计学关联，可能与本研究收集的样本数量小而导致检验把握度不足有关，进而影响分析结果。同时因本研究收集样本数量有限，在分析MTHFR基因型时将杂合突变CT基因型与纯合突变TT基因型合并进行。今后将进一步扩大样本量，探讨二者之间的关系及基因与环境的交互作用对出生体重的影响。为低出生体重的病理发生机制提供科学依据。

参考文献

　　1 林良明，刘玉琳，张新利，等.中国低出生体重儿抽样调查结果[J].中华预防医学杂志，2002，36(3)：149153.

　　2 何平，孟会，张建平.MTHFR基因C677T位点多态性与胎儿生长受限的相关性[J]. 中国妇幼保健，2007，22(35)：50325034.

　　3 J.萨姆布鲁克，E.F.佛里奇，T.曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南[M].第2版. 北京：科技出版社，1992. 465467.

　　4 Wang XB，Zuckerman B，Coffman GA， et al. Aggregation of low birth weight among whites and blacks in the United States [J].New Eng J Med，1995，333:17441749.

　　5 Fodinger M， Horl W H， Sunder G. Molecular biol ogy of 5，10methylenetet rahydrofolate reductase[J] .J Nephrol， 2000，13 (1) :2033.

　　6 Frosst P，B1om HJ，Milos R， et al . A candidate genetic risk factor for vascular disease :a common mutation in methylenetet rahydrofolqtereductase [J].Nat Genet，1995，10 (1) :111113.

　　7 Gris JC， Perneger TV， Quere I， et al. Antiphospholip id/antip roteinantibodies， hemostasis  related autoantibodies， and p lasma homocys2 teine as risk factors for a fist early p regnancy loss， A matched case control study[J].Blood， 2003， 02: 35043513.

　　8 陈大方，胡永华， 杨帆，等. 母亲与婴儿亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性与早产和低出生体重的相关性研究[J].北京大学学报( 医学版)， 2004，36(3)：248253.

　　9 钟秋安， 仇小强， 曾小云， 等. MTHFR和CBS基因多态性与低出生体重的关系研究[J]. 中国优生与遗传杂志，2009，17(3):2224.