关于声长对小鼠下丘神经元声强反应关系的影响

　　　　 作者：杨晓丽 从文东 王晓 肖中举

【摘要】 目的： 探讨声长（sound duration）对听神经元声音强度反应关系的影响。方法： 采用在体细胞外记录方法，通过给予双耳不同声长和声强的特征频率（characteristic frequency， CF）短纯音刺激，记录4～6周BALB/c小鼠下丘神经元听反应，并分别以动作电位发放数（spike counts，SC）和第一发放延时（first spike latency，FSL）为评价指标，分析比较声长对神经元的声强反应关系的影响。 结果： 共记录到35个神经元反应。以发放数为评价指标，这些神经元分别表现出34％单调、26％饱和、40％非单调3种声强反应。较之发放数， FSL能更好地反映声强和声强变化，并展示出同一规律的FSL声强反应曲线：FSL随着声强的增大而缩短。在不同声长下，所有神经元发放数声强曲线和FSL声强曲线基本重合，但后者变异性小。结论： 声长对小鼠下丘神经元强度反应关系无明显影响；相比发放数，FSL则能更准确地反映声强和声强变化。

【关键词】 第一发放延时； 声长； 小鼠； 下丘

　　 在感觉系统对外界信息编码的研究领域里，动作电位发放数/率（spike counts/rate， SC）一直是被广泛采用的反应参数［1～4］。不过，近年来已有不少研究工作者认为动作电位的时间特性可能作为信息载体发挥了更大的作用，并已在听觉、视觉、躯体感觉系统中被证实［5～10］。而且，动作电位发放时间，尤其是第一个动作电位延时（first spike latency，　FSL），较之动作电位发放数/率，携带了更多更精确的感觉信息［4，11～12］。但听觉系统研究中，FSL却受着多种因素的影响，如声强、频率、声刺激的前后信息等［11］。虽说有人认为声长可能影响神经元反应阈值而影响FSL［13］，但却没有实验依据。本实验室前期研究工作虽已经证明了较之SC、FSL更加精确和稳定，能更好地表征刺激声音幅度，但仅限于固定在某一声长下［4］。由于声长同样可以影响SC和FSL［14～16］，但是否声长可改变神经元对声强的反应关系尚无研究。因此，本实验在改变声刺激强度的同时也改变声长，比较并分析声长对小鼠下丘神经元SC声强和FSL声强曲线的影响，以期更一步阐明SC和FSL编码声刺激参数的准确性以及声长对它们的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物
　　
　　实验动物为4～6周龄无听觉障碍BALB/c小鼠，重约9～20g，雌雄不拘，由南方医科大学实验动物中心提供，等级为SPF级。所有实验过程均在南方医科大学动物保护和使用管理委员会的批准和监督下进行。

　　1.2 手术步骤
　　
　　称重后，先给予小鼠腹腔注射阿托品（atropine sulfate，0.25 mg/kg）以减少呼吸道分泌物，然后腹腔注射戊巴比妥钠（sodium pentobarbital，60～70 mg/kg）进行麻醉。待小鼠进入麻醉状态，头皮下注射利多卡因局部麻醉后，再去除头部部分皮肤，清理干净头骨部组织，并将一长约1.5 cm 的平头金属钉垂直粘在头骨表面。而后，将动物置入一泡沫塑料制成的模子中用弹性胶带固定好，并悬吊于防震台上的一个固定支架上。动物头部正对前方30 cm处喇叭，并以平头金属钉固定在一垂直杆上。在手术显微镜下，用钻头在一侧下丘上方开一大约2×2 mm2大小的窗，充分暴露下丘。实验记录过程在无回响、恒温（24～26 ℃）的屏蔽室内进行。实验中使动物保持浅麻醉状态，即存在耳廓反应，但对痛刺激不引起腿部收缩。记录中通过数码摄像头观察动物，当发现有异动或钳刺激引起腿部收缩时即皮下补麻醉剂（15 mg/kg），或正常情况下每小时给该剂量药物维持状态。

　　1.3 声音刺激与数据采集
　　
　　声音刺激与数据采集通过TuckerDavis Technologies系统3（TDT 3， Alachua， Florida， USA）完成。实验采用自由声场给声。实验开始用50 ms的噪音刺激探查神经元反应，再以50 ms短纯音刺激确定其特征频率（characteristic frequency， CF， 最小阈值时的声刺激频率）和最小域值（minimum threshold， MT，特征频率下诱发的0.1发放率的最小声强）。给声速率为1 Hz。之后，将短纯音频率设为神经元的CF，声长为5、10、20、50、100、160、320、640、720 ms（不包括上升和下降时间各5 ms），同时幅度以10～20 dB或1～3 dB（接近MT时）在90 dB SPL至最小域值下10 dB间变化。每个声音刺激随机重复15次。
　　
　　记录电极尖端直径约1 μm，阻抗10～20 MΩ，记录电极内灌注2 M 醋酸钠溶液，通过前置放大器将神经元反应信号放大5000～20000倍，采用数字放大器（RA16）进行滤波(0.3～3 kHz )，通过Brain Ware 软件进行记录和显示，同时通过音频监听器（MS2）监听。选择信噪比大于4：1的反应为动作电位，并收集实验数据。

　　1.4 数据分析和统计学处理
　　
　　除以TDT 3在线数据处理，如动作电位波形、动作电位特性、刺激后时间直方图等，主要以Excel 2003和OriginPro7.5对实验数据进行离线处理，分别以SC和FSL为观测指标对神经元反应与声强和声长作图分析。 OriginPro7.5 统计后的数据形式为：以mean±SD（ ±s）表示。

　　2 结果

　　2.1 一般情况
　　
　　实验共记录到35个单单位神经元，电极垂直插入小鼠下丘的深度为340～1400 μm之间。 神经元CF在12～37 kHz之间，MT在11～69 dB SPL之间。大多数神经元表现为给声 （Onset）型反应，偶尔可观察到持续性（Sustained）反应，且很少神经元有自发放电活动。

　　2.2 声长对SC声强和FSL声强反应曲线的影响
　　
　　由于神经元表现出明显的声强反应规律，为探讨声长对听神经声反应延时的影响，集中观察不同声长对SC声强和FSL声强反应曲线的影响。当以发放数为神经元反应评价指标时，声强反应曲线表现出3种类型：单调型（图1. A1），饱和型（图1. A2）和非单调型（图1. A3）。不同声长下，每一类型反应曲线均有所不同，但反应曲线大致趋势一致。所记录的35个神经元反应，其中34％单调型、26％饱和型、40％非单调型。而以FSL为神经元反应评价指标时，以上3种类型神经元的声强反应曲线只表现出一种形式，即FSL随声强增大而缩短（图1. B1～B3）。而且，不同声长下的FSL声强反应曲线几乎完全重合在一起。以上结果表明SC声强反应曲线易受影响，但其影响与声长关系不明显；而FSL声强反应曲线相对稳定，即FSL表现出较好的保守性和准确性。1， 2， 3分别来自三个不同的神经元

　　图1 不同声长下的SC声强（A）和FSL声强反应曲线（B）（略）

　　3 讨论
　　
　　声刺激除声音频率和声强两种基本参数外，还包括声长。这3个参数间是否有相互关联或相互作用共同影响神经元反应仍是一个值得深入探讨的问题。我们已经知道声刺激的强度可以分别由SC和FSL来表征，虽说已有研究表明用FSL来表征声强更稳定，但仅限于在单声长下的探讨［4］。由于声长同样可以影响SC和FSL［14～16］，我们集中研究了是否声长可影响SC和FSL对声刺激强度的表征。
　　
　　本研究了不同声长下小鼠下丘神经元的SC和FSL对声强的反应关系，我们观察到，无论是以SC还是以FSL来反应声强，基本上不受声长影响。因此，可以认为声长对强度反应关系无影响，即在研究强度反应关系中，通常可以不用考虑声长因素。然而，通过比较分析可以看出，以发放数为反应指标，发放数强度反应关系曲线不但表现出了多型性特点，而且由于声长因素，发放数声强反应曲线上各反应点间差异较大；而以FSL为反应指标，FSL声强反应关系曲线只有一种，且不同声长下各反应点间的差异相对小得多。因此，我们有理由认为，用FSL为声强反应参数更有效；同时支持FSL可能携带了更为稳定的声音编码信息观点［4，11～12］。综上所述，我们可以忽略声长对强度反应关系的影响，进一步为FSL表征声强的准确可靠性提供了新证据。

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