维甲酸联合卡介苗诱导HL-60细胞分化为树突状细胞的实验分析

【摘要】目的 HL-60细胞用经典方法不容易培养成树突状细胞（DC），需探索一种有效获取HL-60细胞源性DC的方法，为APL复发及MDR的免疫治疗提供新的策略。方法 HL-60细胞株在完全培养基中培养，以GM-CSF、IL-4、TNF-α等共处理， 只在实验组加用卡介苗和ATRA。观测细胞形态，检测DC免疫表型、上清夜IL-12水平测定，观察MLR反应。结果 使用卡介苗和ATRA后获得了具有较明显树突状突起的细胞，DC表型CD83为(29.46±2.67)%、CD80为（65.23±4.65)%、CD86为(56±3.76)%、HLA-DR为(27.87±3.64)%及CD1d为(30.11±3.92)%，均明显升高(p&<0.05)，上清液IL-12水平为(182.44±11.96 pg/ml)，亦明显升高(p&<0.05)，并具有明显的MLR反应。结论 利用ATRA联合卡介苗可以成功地诱导HL-60细胞为成熟DC，其CD1d表达明显增高，推测可能参与NKT细胞激活，具体机制需进一步研究。
【关键词】全反式维甲酸 卡介苗 HL-60细胞 树突状细胞
　　树突状细胞（Dendritic cell，DC）是体内功能最强大的抗原递呈细胞(APCs)，其能启动自身特异性杀瘤免疫反应，但DC在人体内所占数量极微。目前 以末梢血中的单核细胞或CD34+细胞，可以诱导培养出大量DCs。国内外有大量实验证明白血病细胞用经典的方法能被诱导成DC。但用经典的方法培养，HL-60细胞很难培养成树突状细胞。
　　19世纪80年代开始了用全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗APL，取得巨大成功。Huang S等报道，JWA（AF070523）作为ATRA的一种靶基因，ATRA作用下使JWA下调，促进NB4、K562、HL－60向粒或单核细胞方向分化。我们实验室已成功地用ATRA诱导分化作用 诱导APL细胞为DC。本实验应用ATRA和卡介苗，观察HL-60细胞能否分化为有功能的DC，为L-DC疫苗提供新的策略。
　　1 材料和方法
　　1.1 细胞和主要试剂
　　IL-12 ELISA为试剂盒为晶美生物公司产品，rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α为Bioscience公司产品，抗人CD1a-PE、CD1d-PE、 CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE、HLA-DR-FITC单抗为Burlingame公司产品，ATRA为山东良福集团制药有限公司产品，卡介苗（ BCGV）上海生物制品研究所。
　　1.2 细胞培养
　　HL-60细胞在含体积分数为10%的小牛血清的RPMI-1640完全培养液中，在37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中贴壁培养，隔日换液，根据细胞增殖密度进行传代。
　　1.3 实验分组
　　调整细胞浓度为1×106/ml，分别接种于24孔培养板（1ml/孔）。ATRA溶解于无水乙醇。实验组依需加入ATRA（终浓度为1×10-6 mol/L）、rhGM-CSF（终浓度为1000U/ml）、rhIL-4（终浓度为500U/ml）、卡介苗（终浓度为3×104cfu），在培养第8天时，加入100ng/ml的TNF-a，继续培养72小时。对照组使用rhGM-CSF、rhIL-4及TNF-a和无水乙醇作为对照。空白对照组仅使用rhGM-CSF及rhIL-4及TNF-a。
　　1.4 DC的形态及表型检测
　　倒置显微镜动态观察细胞并摄片，将培育DC浓度调节为1×106/ml，取细胞悬液100μl/管，分别加入CD1a-PE、CD1d-PE 、CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE及HLA-DR-FITC单抗各15μl，混匀反应30min，流式细胞仪进行分析。
　　1.5 IL-12测定
　　上清液IL-12水平测定，具体操作按ELISA 试剂盒说明书进行。
　　1.6 CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（MLR）
　　L-DCs用丝裂霉素(25μg／L)处理1 h去增殖后作为刺激细胞，刺激健康自愿者外周血T细胞(DC：T细胞分别为1：100，1：50，1：10，1：1)与2×105个／ml的T细胞在96孔圆底培养板中作用5天。总体积为每孔200μl，对每个浓度均作3个平行孔，每孔加入CCK8（20 μl/孔）在37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中培养4 h，用酶标仪检测波长450 nm时的吸光度(A)值，参比波长为630 nm，结果取均值。算刺激指数(SI)。SI=实验孔的A值／对照孔的A值。
　　1.7 统计学分析
　　采用SPSS16.0软件，所测数据用均数±标准差（x-±s）表示，采用one-way analysis of variance (ANOVA)统计方法分析分析。 P&<0.05表示有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 形态学观察
　　实验组约11天后出现典型树突状突起，对照组突起不明显。
　　2.2 DC表型分析　　
　　第11天用流式细胞仪检测其表型，除CD1a外，实验组CD80、CD83、CD86、HLA-DR均较对照组及空白对照组明显增高(p&<0.05 )，见表1。
　　表1. HL-60 -DCs表型分析（%，x-±s）
　　
　　注：＊示实验组与对照组和空白对照组有显著性差异p&<0.05
　　2.3 IL-12水平测定
　　培养第11天，实验组上清液IL-12分泌水平较对照组及空白对照组明显增高(p&<0.05 )，见图1。
　　
　　图1 IL-12水平
　　注： ＊示实验组与对照组和空白对照组有显著性差异，p&<0.05 　　 2.4 混合淋巴细胞反应（MLR）
　　通过维甲酸和卡介苗成熟佐剂作用的HL-60-DC具有较强的刺激异基因淋巴细胞增殖的能力，且刺激能力随HL-60-DC/T细胞比例的增加而升高，见图2。
　　
　　图2 混合淋巴细胞反应（MLR）
　　注： ＊示有显著性差异，p&<0.05
　　3 讨论
　　目前较成熟的体外培养树突状细胞（DC）方法多采用CD34+细胞及CD14+的单个核细胞以GM-CSF+IL-4培养，然后用TNF-α促进成熟。由于白血病细胞和DC来源于共同的造血前体细胞，因此白血病细胞可以诱导分化为DC（L-DC），但急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞用经典的方法，却很难被诱导分化为DC。我们实验中用经典的方法（GM-CSF+ IL-4）培养，CD83表达或细胞形态树突状突起并不理想，这与国内外一些报道一致。
　　CD83是成熟DC的标志。DC成熟时大量分泌IL-12，并且IL-12对DC功能亦有关重要的作用，所以IL-12水平是衡量DC成熟的重要因素。我们实验证实DC的表型HLA-DR、CD80、CD86 及CD83的表达均明显升高，并且本实验中DC分泌的IL-12水平明显增高。我们之前实验由ATRA诱导HL-60为DC，其刺激异基因T细胞增殖作用较弱，但本实验中加用卡介苗佐剂后，可以诱导明显的混合淋巴细胞反应。由此可见，ATRA和卡介苗诱导HL-80细胞分化为有功能成熟DCs。
　　国外报道ATRA可以提高正常DC的CD1d表达。我们的实验发现ATRA联合卡介苗也能提高HL-60细胞源性DC的CD1d表达。抗肿瘤的分子机制，亦可以通过CD1d递呈脂类抗原，激发NKT细胞增殖，诱导NKT细胞抗肿瘤作用及调节免疫作用。NKT细胞对抗原识别有CD1d限制性，已经证实CD1d传递脂类抗原后诱导NKT细胞大量表达IL-12R，从而使NKT活化，若IL-12缺乏时NKT不能被正常激活。由于ATRA能提高HL-60细胞源性DC的CD1d表达，并且IL-12水平明显增高，故可能有激活NKT细胞的作用，但需进一步研究证实。
　　综上所述，本实验利用ATRA和卡介苗成功诱导出成熟的HL-60-DC，并且其CD1d表达明显增高，推测有NKT细胞激活的可能。
参 考 文 献
[1] Schwarz FS，Coppock DL，Alexander A，et al. Identification of a malignant counterpart of the monocyte –dendritic cell progenitor in an acute myeloid leukemia [J].Blood，1994 Nov 1，84(9):3054-62.
[2] Dreyssiq J， Kremser A， Liepert A， et al. Various ’dendritic cell antigens’ are already expressed on uncultured blasts in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes [J].Immunotherapy.2011 Sep;3(9):1113-24.
[3] Antonio Curtia，Simona Pandolfia，Michela Aluigi，et al，Interleukin-12 production by leukemia-derived dendritic cells counteracts the inhibitory effect of leukemic microenvironment on T cells [J].Experimental Hematology 2005;33:1521-1530.
[4] Hung S，Shen Q， Mao WG ，et al JWA， a novel signaling molecule， involved in the induction of differentiation of human myeloid leukemia cells Biochem Biophys Res Commun [J].2006 Mar 10;341(2): 440-50.
[5] Hung S，Shen Q，Mao WG， et al JWA， a novel signaling molecule， involved in all-trans retinoic acid induced differentiation of HL-60 cells [J].J Biomed Sci.2006 May 13(3):357-71.
[6] Zhu T，Chen R，Li AP，Regulation of a novel cell differentiation -associated gene， JWA during oxidative damage in K562 and MCF-7 cells.J Biomed Sci [J].2005;12(1):219-227.
[7] 田发青，张连生，王春燕，等.全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化为树突状细胞的实验研究[J].中国实验血液学杂志，2008，16(5):1140-1145.
[8] Istvan Szatmari， Attila Pap， Ralph Ruhl， et al. PPARγ controls CD1d expression by turning on retinoic acid synthesis in developing human dendritic cells [J]. JEM， 2006 Oct 2; 203(10):2351-2362.
[9] Duthie MS， Kahn M，White M，et al. Both CD1d antigen presentation and interleukin-12 are required to activatenatural killerT cells during trypanosoma cruzi infection [J].Infect Immun，2005 May;73 (3):1890-4.