作者：王春梅 赓迪 徐宋瑶 陈伟东
【摘要】本实验研究暹罗鳄鳄鱼血粉对小鼠免疫功能的影响。采用6.4、1.6、0.4mg/kg bw剂量的鳄鱼血粉给小鼠经口灌胃 30d，进行小鼠脾淋巴细胞增殖反应实验、单核巨噬细胞吞噬实验、NK细胞杀伤细胞实验。结果发现：与阴性对照组比较发现，鳄鱼血低、中、高剂量和猪血组能促进脾淋巴细胞增殖反应（P＜0.05）；鳄鱼血粉中、高剂量组能促进小鼠单核巨噬细胞吞噬能力（P＜0.05）；鳄鱼血粉中、高剂量组能提高小鼠NK细胞的杀伤能力（P＜0.05）。结论 证明鳄鱼血粉具有增强免疫力的作用。
【关键词】鳄鱼血粉 脾淋巴细胞增殖反应 单核巨噬细胞吞噬指数 NK细胞活性 免疫功能
【Abstract】In order to study the effects of Crocodylus siamensis blood powder on immune function of normal mice， lymphocyte transformation capacity induced by ConA， antibody forming spleen cells (AFPC)， NK cell activity were determined after mice were orally administered with the Crocodylus siamensis blood powder at doses of 6.4， 1.6 and 0.4 mg/kg. bw for 30 days. Compared with the control group， the Crocodylus siamensis blood powder at dose of 1.6 mg/kg.bw could significantlyNK cell activity and lymphocyte transformation capacity induced by ConA in mice（P＜0.05）. These results indicate that the Crocodylus siamensis blood powder can improve immune function in mice.
【Key words】the Crocodylus siamensis blood powder lymphocyte transformation capacity phagositosis of peritoneal macrophages NK cell activity immune function
随着鳄鱼人工养殖的成功，其价值得到多方面的开发，包括旅游观赏、餐饮加工、时装皮具等。自1999年Sharbanay报道海水鳄血清有抗菌活性以来，国外、国内许多学者对鳄鱼血的功效进行了研究，发现鳄鱼血具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等方面的作用[1-5]，鳄鱼血的这些功能是否是通过调节免疫来实现的呢？关于鳄鱼血的免疫增强作用尚未见报道。因此，本实验以小鼠为研究对象，探讨鳄鱼血对正常小鼠免疫功能的影响。
1 材料与方法[6]
1.1 材料与试剂
鳄鱼血采自人工养殖暹罗鳄(Crocodylus siamensis)，来源于海南三亚龙虎园养殖场，本试验室制备。
清洁级 BALB/C 小鼠，雄性，60只，18～22g。刀豆蛋白 A(ConA)、染液、Hanks 液(pH7.2～7.4) RPMI1640 完全培养液、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑 (INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、Tris-HCl 缓冲液(pH8.2)、1%NP40、台盼兰、1mol/L 盐酸等。
1.2 仪器与设备
5mm 直径打孔器、显微镜、微量血凝试验板、离心机、酶标仪、96 孔培养板、5%CO2 培养箱、200 目筛网、注射用墨汁、721 型分光光度计。
1.4 动物实验分组与剂量设定
实验动物用于2项实验，分别为碳廓清实验和脏器/体重实验、小鼠脾淋巴细胞转化实验。每项 50 只动物，分为5个组，每组 10 只动物，分别为对照组、4倍人体摄入量组、1倍人体摄入量组、0.25倍人体摄入量组和猪血对照组。1倍人体摄入量为400mg/天。灌胃体积为0.2ml/20g bw。
1.5 指标测定
1.5.1ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
小鼠连续灌胃 30d 后，颈椎脱臼处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，经 200 目筛网过滤，制成单细胞悬液，将细胞悬液分为两部分，用于 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验。
用Hanks液洗涤细胞悬液2次，每次离心10min (1000r/min)，然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中，台盼兰染色计数活细胞数(在95%以上)，调整细胞浓度为 3 ×106个/ml。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液作为实验，另一孔作为对照，置培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含血清的RPMI1640培养液，同时加入 MTT 50μl/ 孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入 1ml 酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。以实验孔与对照孔OD的差值代表淋巴细胞增殖能力。
1.5.2 小鼠NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)
实验前24h按常规培养靶细胞、效应细胞，取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1)，加入96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl、靶细胞最大释放孔加靶细胞和 1%NP40 各100μl，上述各项均设三个复孔，于37℃、5%CO2 培养箱中培养4h，然后将培养板1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100μl置96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
1.4.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
小鼠连续灌胃30d 后，每鼠腹腔注射2% 鸡红细胞悬液 1ml。30min 后，颈椎脱臼处死动物，仰位固定于蜡板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板 1min，然后吸出腹腔洗液 1ml，平均分滴于2 片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，于37℃孵箱温育 30min。孵毕，在生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞。晾干，以 1:1(V/V)丙酮甲醇溶液固定 20min，4%(V/V)Giemsa- 磷酸缓冲液染色 3min，再用蒸馏水漂洗晾干，于显微镜下计数巨噬细胞。吞噬百分率与吞噬指数按以下公式计算。
1.5 统计学方法
测定结果数据均用x±s 表示，用SPSSl6.0软件对结果进行t检验统计学处理，P＜0.05为差异有显著性意义。对于NK细胞杀伤活性的实验，结果采用秩和检验分析。
2 结果
2.1 鳄鱼血粉对小鼠脾淋巴细胞转化的影响
结果显示：鳄鱼血各个剂量组均能促进小鼠淋巴细胞的转化（P&<0.05），且随着剂量增加呈现线性关系。见表1
表1 鳄鱼血粉对ConA诱导后OD值的影响
注：*与正常组比较，P&<0.05。 △，与正常组比较，P&<0.01
结果显示：中剂量组与高剂量组的鳄鱼血粉均能提高小鼠单核巨噬细胞的功能（P&<0.05）。见表2
表2 对小鼠单核巨噬细胞功能的影响
注： *与正常组比较，P&<0.05。
2.3 鳄鱼血粉对小鼠NK细胞杀伤能力的影响
结果可知，鳄鱼血粉中高剂量均能促进小鼠NK细胞的细胞杀伤能力。见表3
表3对小鼠NK细胞活性的测定结果
* 经秩和检验，P&<0.05，上述各组具有统计学差异。
3 讨论
鳄鱼血粉0.4、1.6、6.4mg/kgbw脾淋巴细胞转化实验呈阳性结果；小鼠单核-巨噬细胞功能实验结果表明，小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验表明，高剂量组的吞噬指数显著高于对照组，呈阳性结果；NK 细胞活性测定实验表明，与对照组比较，中、高剂量组 NK 细胞的活性显著升高，呈阳性结果。由以上结果表明鳄鱼血粉具有增强小鼠免疫力功能。
参 考 文 献
[1] Sharbanay M， Gollop N， Ravin S， et a1. Naturally occurring antibacterialactivities of avian and crocodile tissues [J]. J Antimicrob Chemother， 1999， 44: 416～418．
[2] Merchant M， Thibodeaux D， Loubser K， et al. Amoebacidal effects of serum from the American alligator (Alligatorm mississippiensis)[J]. Parasitol， 2004， 90: 1480～1483.
[3] Merk E Merchant， Noelle Leger， Erin Jerkins， et al. Broad spectrum antimicrobial activity of leukocyte extracts from the American alligator (Alligatorm mississippiensis)[J]. Veterinary immunology and immunopathology， 2005， 5: 221～228.90(9): 4266～4270.
[4] 许东晖，马海萍，梅雪婷，许实波. 鳄鱼血浆体外抗菌实验研究[J]. 中国海洋药物，2008，(1): 33～39.
[5] 邹黎黎，罗永煌，郝娟，梁桂英，李安兴. 暹罗鳄外周血白细胞提取物抗海豚链球菌感染的效果[J]. 中国兽药杂志，2008，(5).
[6] 徐叔云， 卞如濂， 陈修 药理实验方法学 第三版 人民卫生出版社 2002.