作者：李芳 刘攀 宋鄂 董宇 陈雪艺
【摘要】目的 观察不同时间的缺氧条件下视网膜Müller细胞凋亡情况。方法 缺氧3h、6h、12h、24h、48h、72h条件下培养视网膜Müller细胞，AO/EB染色后共聚焦显微镜观察。结果 缺氧3h、6h、12h、24h、48h、72h细胞凋亡率分别为4%、7%、10%、13%、17%、23%，随着缺氧时间的延长，凋亡细胞逐渐增多。结论 为了确保缺氧条件下一定的活细胞数量，排除过多的细胞凋亡因素对实验结果的影响，缺氧条件下视网膜Müller细胞的研究应选择凋亡细胞20%以下的缺氧时间（48h内）作为进一步研究的时间范围。
【关键词】视网膜 Müller细胞 缺氧 AO/EB染色 凋亡
糖尿病视网膜病变﹙diabetic retinopathy，DR﹚是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常见和严重的微血管并发症，是四大致盲疾病的主要原因之一。近年来随着糖尿病发病率逐年增加，其严重性也日趋明显[1]。在DR的发病过程中，两个最重要的因素就是高糖和缺氧。高血糖状态可导致血粘滞度增加，引起糖基化终产物的堆积并导致血管内皮功能受损；而缺氧促进许多细胞因子的释放，增加血管通透性，引起新生血管的形成，并导致视网膜血管充血、扩张、扭曲和出血，降低血-视网膜屏障的功能。视网膜Müller细胞是一种特化的神经胶质细胞，具有维持视网膜的正常结构、营养视网膜神经元、参与构成血-视网膜屏障等多种生理功能，而且还参与视网膜的多种病理生理过程[2]，研究证明DR的神经元的功能丧失和死亡归因于Müller细胞的反应性变化[3]。因此阐明缺氧对视网膜Müller细胞的影响及其在DR发病过程中的作用有重要的意义，本实验旨在观察不同时间的缺氧条件下视网膜Müller的凋亡情况，为进一步进行缺氧实验奠定理论和实验依据。
材料与方法
一、材料
1.实验动物：健康成年大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供，雌雄不限。
2.主要试剂：DMEM培养基（Gibco BRL Co.），标准胎牛血清（Hylclone Co.），
胰蛋白酶（Hylclone Co.），AO（吖啶橙Acridine orange）/EB（溴乙锭Ethidium bromide，EB）染色剂（鼎国公司）。
3.主要仪器设备：CO2恒温培养箱（Theromo Forma），低氧培养箱（Theromo Forma），激光共聚焦显微镜FV500（日本Olympus），20000T台式高速离心机（Sartouris），微量电子天平（Sartouris），倒置显微镜（日本Olympus）。
二、方法
1.Müller细胞的培养及鉴定[4]：采用组织块悬浮法培养视网膜Müller细胞，GFAP免疫组织化学法鉴定视网膜Müller细胞。
2.实验分组：第2代培养细胞（P2）用于实验。将融合生长的P1代Müller细胞（细胞计数：7×105/ml）传代于24孔板中，使细胞均匀分布于各孔，至细胞达到80%融合时，放入5%CO2、5%O2低氧培养箱，低氧培养时间分别为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h，其中0h组为正常对照组。
3.AO/EB染色检测Müller细胞在缺氧条件下细胞凋亡情况：（1）分别在缺氧0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h后取出24孔板，吸出孔中液体，0.25%胰蛋白酶消化，转入EP管800r/min，离心5min，弃上清。（2）0.1mol/L PBS洗3min×1，800r/min，离心5min，弃上清。（3）0.5ml 0.1mol/L PBS悬浮细胞后，分别加入AO及EB各5μl，混匀，激光共聚焦显微镜490nm激发，观察细胞形态并计数。
4.结果判定：活细胞(VN)：核染色质着绿色荧光，且形态结构正常；早期凋亡细胞(VA)：核染色质虽也着绿色荧光，但形态呈固缩状、圆珠状或新月状；晚期凋亡细胞(NVA)：核染色质着橘红色荧光，形态也呈固缩状或圆珠状；非凋亡死细胞(NVN)：核染色质虽也着橘红色荧光，但形态结构尚正常。每孔随机计数200个细胞，每组观察3孔，实验重复3次，结果以百分率表示。细胞凋亡率=（NV＋NVA）/（VN＋NVN＋VA＋NVA）×100％
5.统计学分析：运用SPSS15.0统计软件处理数据。
结果
AO/EB染色后在荧光显微镜下观察各组培养细胞的形态(图1，2，3，4)。结果显示：缺氧0h的正常对照组细胞形态结构正常，呈黄色荧光；缺氧3 h组个别细胞形态结构发生变化，并且核染色质出现橘红色荧光，提示出现早期凋亡细胞；随着缺氧时间的延长，凋亡细胞逐渐增多。在缺氧3h、6h、12h、24h及48h，细胞凋亡率分别为4%、7%、10%、13%及17%，表明缺氧在48 h以内凋亡细胞增加不明显；缺氧72 h凋亡细胞达到23%，说明缺氧超过48h后细胞凋亡明显（见表1、图5）。
72 23图5不同缺氧时间AO/EB染色检测细胞凋亡率
讨论
凋亡（apoptosis) 是细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程，是机体对有害因素引起的损害性的自卫反应。凋亡细胞在形态特征、生化代谢及生物水平上发生一系列改变，目前检测细胞凋亡的方法很多，但一般认为形态学变化是判断凋亡的基础[5]。本实验采用AO/EB两种荧光染料双染色，AO能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA中，使之发出亮绿色荧光，荧光较强时，可呈黄色；EB只能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光[6]；有的细胞表面均匀的绿色亮荧光之间透出红色荧光，提示细胞中央有坏死或凋亡的细胞[7]。本实验结果显示Müller细胞在缺氧3h、6h、12h、24h、48h、72h，橘红色细胞逐渐增多，绿色细胞逐渐减少，细胞凋亡率在缺氧72h达到23%，表明随着缺氧时间的延长，凋亡细胞逐渐增多。我们应选择细胞凋亡率20%以下的缺氧时间（48h内）作为进一步研究的时间范围以确保缺氧条件下一定的活细胞数量，从而排除过多的细胞凋亡因素对实验结果的影响。
参 考 文 献
[1]Xiang H D.The morbitity of chronic complication of Chinese patiens with DM within 1991-2000.Diabetes Research and Clinical Prac-tice，2000，56:84.
[2]周霞，夏晓波视网膜Mǔller细胞谷氨酸转运体及其功能调节，国际眼科杂志，2003，3（3）：56-58.
[3]E.L. Fletcher， J.A. Phipps and J.L. Wilkinson-Berka，Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes，Clin. Exp. Optom. 2005，88:132-145.
[4]E Song，Wei Yang，Zhi-Hua Cui，et al. Effects of high-concentration insulin on expression of vascular endothelial growth factor in cultured Müller cells in vitro. International Journal of Ophthalmology，2004，4:201-205.
[5]胡明昌，许宏岳.细胞凋亡的检测方法研究进展[J] . 国外医学临床生物化学与检验学分册，1996，17 (6) : 244.
[6]汪承亚，盛瑞兰.细胞凋亡与肿瘤.国外医学生理、病理科学与临床分册，1996， 16(4) : 291.
[7]Guan H J，Gong Q R.Modern Basic Ophthalmology.Beijing:Peopl-e，s Militar Medical Press，1998:534-535.