关于CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选

【摘要】 目的 筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表面与人CD59特异性结合的短肽序列，为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法 以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选，并进行竞争结合实验，双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序，并推导出短肽序列。结果 随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力，经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论 通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。
【关键词】 噬菌体肽库 蛋白质CD59 短肽封条
［ABSTRACT］ObjectiveTo screen the sequence of short active peptide binding to human CD59 of the surface of CHO cell， and provide an experimental basis for designing an tumorsneakingthroughrelated active shortpeptide medicine of CD59. MethodsTaking CHO cells protein as target cells by ionexchange chromatograph，a fiveround affinity screening was done randomly．After a competitive test， positive phage clones were identified by sandwich ELISA and sequenced. ResultsTen out of 16 phage clones were identified to have higher combination with CD59. ConclusionThe sequence of peptide binding to CD59 is obtained by screening of CHO cell protein through phage random peptide library.
　　［KEY WORDS］ phage peptide library; protein CD59; shortpeptide clamp
　　新近发展的噬菌体递呈随机肽库(phage display random peptide library)技术，在受体表位的确定和小分子肽类药物的设计中已突显优势。在受体表位模拟肽的研究中，可以从噬菌体肽库中筛选出与配体结合的表位，它们模拟的可以是线性表位，也可以是构象型表位［1～3］。本实验利用噬菌体肽库对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）纯化蛋白进行筛选，以期获得与CD59蛋白特异结合的多肽，并分析多肽片段的特异性，以选择肿瘤导向治疗的载体，为体外合成更为高效和特异的阻断CD59肿瘤逃逸相关位点的短肽药物提供新的研究途径。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　本文噬菌体随机肽库Ph.D.12、宿主菌E.coli ER2738以及测序引物5′HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG3′均购自New England Biolabs公司。RPMI 1640培养基购自Hy Clone公司。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)为北京中山生物技术有限公司产品。鼠抗人M13单克隆抗体购自于Amersham公司。TritonX100、IPTG/Xgal、PEG8000均购自华美公司。CHO细胞由本实验室保存。抗噬菌体M13Ⅷ蛋白单克隆抗体购于Pharmacia公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 酶标板的包被与封闭 使用0.1 mol/L的NaHCO3(pH 8.6)缓冲液分别将纯化蛋白稀释为100 mg/L、50 mg/L两种浓度，各取100 μL加入到酶标孔底部（100 mg/L包一个板，50 mg/L包3个板），4 ℃过夜。次日弃去包被液，加入以 0.1 mol/L的NaHCO3缓冲液(pH 8.6)配制的体积分数0.01的BSA溶液150 μL，4 ℃封闭1 h。之后用PBST溶液洗板6次，备用。
　　1.2.2 噬菌体肽库的筛选 首先取一个浓度为100 mg/L的板，在包被孔中加入50 μL自扩增肽库（用50 μL的TBST稀释），室温振摇45 min，弃去未结合的噬菌体，再用TBST洗10次，加入100 μL pH 2.2的甘氨酸洗脱液于室温作用10 min，并不时振荡，加入15 μL的Tris中和，收集洗脱液后，计数、扩增，用于第2轮筛选。后4轮筛选包被浓度均为50 mg/L，提纯噬菌体。5轮筛选结束后，测定滴度并在IPTG/Xgal琼脂板上随机挑取16个蓝色噬斑进行大量扩增提纯。
　　1.3 可结合噬菌体肽库克隆的鉴定
　　用CHO细胞裂解蛋白纯化蛋白(每孔50 μL，加50 μL包被液)包被酶联板，4 ℃孵育过夜。用1 g/L牛血清清蛋白（BSA）封闭后，将50 μL噬菌体肽库加入到包被纯化蛋白和仅包被碳酸盐缓冲液的孔中，37 ℃作用1 h，后以1∶100鼠源性M13Ⅷ单抗37 ℃作用1 h，1∶2 000 HRP羊抗鼠抗体37 ℃作用1 h，以OPD底物显色后，最后测定波长490 nm处吸光度（A）值。以包被碳酸盐缓冲液为阴性对照。
　　1.4 与野生型噬菌体M13的竞争结合实验
　　将第2、3、4、5轮筛选扩增后的噬菌体及随机挑选扩增后的10个噬菌体分别与野生型M13噬菌体以1∶1的比例混合，加入到已包被CHO细胞纯化蛋白的酶标板中进行前述洗脱筛选裂解过程。
　　1.5 DNA序列测定
　　扩增并按NEB试剂盒纯化阳性噬菌体克隆，抽提单链DNA，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。使用NEB公司提供的测序引物送上海生工生物公司全自动测序。
　　2 结　　果
　　2.1 十二肽库筛选
　　在5轮筛选中，逐轮缩短与靶蛋白的作用时间，筛选结果回收率逐轮提高，显示出较好的富集效果，但第4轮过后回收率并未呈现数量级的增加，甚至略为降低。见表1。表1 高表达人CD59的CHO细胞的筛选
　　2.2 与野生型M13噬菌体竞争结合实验
　　将10个随机挑选的单克隆和4轮筛选后的噬菌体库分别与野生型M13噬菌体进行竞争结合实验，1～10号单克隆的结合力分别为：20、25、23、30、26、27、22、25、28、31；4轮筛选后的噬菌体库的结合力分别为：3、10、25、29，呈逐渐增高的趋势，但第4、5轮之间差异不大。
　　2.3 噬菌体克隆与人CD59的结合　
　　利用ELISA方法对竞争结合实验后的10个噬菌体克隆进行鉴定，其中6个克隆与CD59有较强结合力，其吸光度值分别为0．354、0．234、0．226、0.312、0．932、0.506，噬菌体原库作为阴性对照，其吸光度值为0.053。
　　2.4 DNA测序并推导氨基酸序列
　　提取10个阳性克隆的单链DNA，进行序列分析，结果得到两种氨基酸，序列如下：ACHWWHAWTC、ACWWFHPHLC，两种序列的疏水性氨基酸数目分别为2和4个。
　　2.5 推导的氨基酸序列与蛋白质数据库的比对
　　将上述序列提交蛋白质数据库（http：//pir.georgetown.edu/）进行比对，未发现有同源性一致的序列。将所得序列用DNAstar Megalign Clustal W软件与CD59的天然配体CD2蛋白序列进行比对，显示两序列与CD2有一定的同源性。
　　3 讨　　论
　　近年来，恶性肿瘤成为严重威胁人类健康的常见病，目前的抗肿瘤药物存在选择性低、毒性大、易耐药、免疫抑制、远期疗效不佳等缺点，寻找特异性作用于肿瘤组织或细胞的抗瘤药物是全球医学界研究的共同目标。以重组噬菌体随机肽库载体为代表的小分子载体系统由于分子较小，组织穿透性好，且不易在体内诱发免疫应答，为这一目标的实现提供了一条新的途径。由于在肿瘤细胞中存在多种高表达的已知与未知的细胞分子，如过度表达的特定受体分子，特异性的细胞表面突变蛋白等，因此以肿瘤细胞表面或内部的天然受体作为筛选分子，采用多轮竞争洗脱的全细胞筛选方法可找出与肿瘤细胞特异性结合的噬菌体短肽［4］。本实验以CHO细胞纯化的CD59蛋白为靶蛋白进行噬菌体12随机肽库的筛选，以期得到与人CD59靶分子相结合的关键性氨基酸残基，并合成具有封闭与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽封条。本实验的设计特点：①以亲和层析柱提纯CHO细胞裂解蛋白的纯化蛋白为靶分子；②高表达的人CD59的CHO细胞虽非肿瘤细胞，却有体外多次传代等类似肿瘤细胞的生物学特性，且较少表达非特异性蛋白；③通过加大每一轮肽库的投入量，减少作用时间，加强洗脱力度，从而提高了筛选的特异性和亲和性，更有利于得到目的序列。
　　目前，在多种实体肿瘤细胞中发现有CD59分子的过表达，并与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关。而研究证实在大多数实体瘤细胞膜表面存在CD59等一系列的膜补体调节蛋白，使得肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视以及靶向单抗治疗中由补体介导的溶细胞作用［6，7］。如前列腺癌细胞PC3的发生发展与CD59密切相关，其细胞中过量表达的CD59分子是导致恶变的一个重要因素，并直接导致癌细胞逃逸机体的免疫监视，从而促进癌细胞的生长［8，9］。本实验经过5轮的亲和洗涤裂解扩增筛选过程，其中前4轮筛选后的回收率逐渐增高，说明可特异性与CHO细胞结合的目的噬菌体在逐步富集［5］，第5轮回收率数量级与第4轮相近，这可能是由于每轮投入的噬菌体量达1012数量级之多，而细胞中能特异性与噬菌体多肽结合的受体数量有限，致使受体出现饱和状态，或者由于噬菌体大量聚集产生空间障碍而使回收的噬菌体停留在107数量级上［4］。

本实验将所得序列使用DNAstar Megalign Clustal W软件与CD59的天然配体CD2蛋白序列分别进行比对［10］，显示CD2蛋白序列的第5、34、59、96、137、138、139位氨基酸与所得序列1相应氨基酸×C×WWH×WTC相同且相隔距离较近；第9、34、59、71、96、133位氨基酸与所得序列2相应氨基酸A×WWFHP×××相同且相隔距离较近。说明所得两序列与CD2具有一定的同源性。我们发现对一个线性蛋白而言，抗原表位或与其配基相结合的表位通常为蛋白分子中的一段氨基酸序列，但非线性蛋白抗原的表位可能不是蛋白抗原本身的序列，而是由空间构象中相互接近的几个氨基酸组成的，在一级结构中互不连续，此即模拟表位。模拟表位的氨基酸序列可能与配基截然不同，但能诱导出类似甚至更强的免疫反应或结合反应。蛋白质之间的相互作用特性和亲合力主要决定于少数几个关键氨基酸残基，含有关键氨基酸残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定簇，主导蛋白质之间的识别和相互作用。而本课题组的前一项研究结果显示，CD59分子中N37～H44位点氨基酸与人类糖尿病血管增殖症的发生密切相关，其NMR结构同样显示抗补体活性区域也主要集中于N37～H44之间［11］。肿瘤逃逸相关活性位点是否位于N37～H44区域或附近尚待研究，但无疑为本课题寻找该活性位点提供了可行性依据，为我们下一步进行计算机模拟空间构型及进一步寻找特异性与CD59分子结合的短肽封条奠定了理论基础。
　　基于上述研究，下一步应体外合成这些短肽片段，建立动物肿瘤模型进行体内研究，并为下一步设计具有特异性的短肽模拟药物打下坚实的基础。

参考文献

［1］陈政良，谢佩蓉. C1q调理酵母多糖颗粒刺激Ｕ937细胞产生ＴＮＦα［J］. 免疫学杂志， 1996，12(1):913.

［2］王细文，梁平，韩本立. 应用噬菌体随机肽库研究蛋白质抗原表位的进展［J］. 免疫学杂志， 2000，16(4):313314.

［3］AZZAZY H M， HIGHSMITH W E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations ［J］. Clin Biochem， 2002，35(6):425445.

［4］梁国栋. 最新分子生物学实验技术［M］. 北京:科学出版社， 2001：109125.

［5］高双荣，钟雪云，颜艳灵，等. 利用噬菌体随机肽库对神经胶质瘤母系swo38进行全细胞筛选［J］. 中国病理生理杂志， 2002，18(8):946948.

［6］FISHEISON Z， DONIN N， ZELL S， et al. Obstacles to cancer immunotherapy: expression of membrane complement regulatory proteins (mCRPs) in tumors ［J］. Mol Immunol， 2003，40(24):109123.

［7］DE N C， FONSATTI E， SIGALOTTI L， et al. Recombinant transmembrane CD59 (CD59TM) confers complement resistance to GPIanchored protein defective melanoma cells ［J］. J Cell Physiol， 2002，190(2):200206.

［8］BABIKER A A， NILSSON B， RONQUIST G， et al. Transfer of functional prostasomal CD59 of metastatic prostatic cancer cell origin protects cells against complement attack ［J］. Prostate， 2005，62(2):105114.

［9］CHEN S， CARAGINE T， CHEUNG N K， et al. CD59 expressed on a tumor cell surface modulates decayaccelerating factor expression and enhances tumor growth in a rat model of human neuroblastoma ［J］. Cancer Res， 2000，60(11):30133018.

［10］DIAMOND D J， CLAYTON L K， SAYRE P H， et al. Exonintron organization and sequence comparison of human and murine T11(CD2) genes［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1988，85(5):16151619.

［11］高美华，王秋波，张艳丽，等. 人突变CD59基因表达蛋白功能的研究［J］. 青岛大学医学院学报， 2005，41(3):220223.