关于CD59基因抗HeNe激光诱导凋亡的作用

【摘要】 目的 探讨CD59基因抗HeNe激光诱导凋亡的作用。方法 将小鼠随机分成两组，小鼠背部脾区皮下分别接种HeLa细胞（Ⅰ组）、转CD59基因HeLa细胞（Ⅱ组），接种24 h后采用24 mW的HeNe激光器照射小鼠脾区(瘤区)，然后采用免疫组化方法检测凋亡相关基因 Fas、B细胞淋巴瘤白血病基因2（bcl2）、细胞核因子κB （NFκB）的表达。结果 Ⅰ组瘤块质量及bcl2、NFκB表达明显低于Ⅱ组，两组比较差异有显著性（t=9.169，Z=－2.328、 －2.367，P＜0.05）。Ⅱ组Fas的表达与Ⅰ组比较无显著差异（Z=－0.643，P＞0.05）。结论 CD59基因可促进肿瘤细胞的生长及bcl2、NFκB的表达，具有抗HeNe激光诱导凋亡的作用。
【关键词】 抗原 CD95 基因 bcl2 NFκB 激光
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effect of CD59 gene on apoptosis of HeLa cell induced by HeNe Laser. MethodsHeLa cells were injected subcutaneously into the back of the mice in groupⅠ， and HeLa cells transfected with CD59gene into the back of the mice in group Ⅱ. After 24 h of the injection， the mice received HeNe laser radiation. Expressions of Fas， bcl2 and NFκB in tumor tissue were demonstrated via immunohistochemistry technique. ResultsCompared with group Ⅱ， tumor weight and the expressions of bcl2 and NFκB in groupⅠwere significantly lower (t=9.169；Z=－2.328，－2.367；P＜0.05)， while difference in the Fas expression between the two groups was not significant (Z=－0.643， P＞0.05).ConclusionCD59 gene may promote the expressions of bcl2 and NFκB， suggesting its antiapoptosis effect.
　　［KEY WORDS］antigens， CD95； genes， bcl2； NFkappa B; lasers
　　CD59是补体终末段的一种调节蛋白，它具有抑制补体攻膜复合物的形成、保护正常组织免受补体溶解的作用。近年来对CD59与肿瘤关系的研究比较深入，发现其与肿瘤的生长失控及转移密切相关[1]。本研究采用HeNe激光照射小鼠瘤区的方法，探讨CD59基因抗HeNe激光诱导凋亡的作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　HeLa细胞、转CD59基因Hela细胞由本室保存[2]。凋亡相关基因 Fas、B细胞淋巴瘤白血病基因2（bcl2）、细胞核因子κB （NFκB）免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。HNZSQⅡ型氦氖激光照射器为上海医用激光仪器厂产品。
　　1.2 动物选择与分组
　　取BALB/C纯系小鼠32只，体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为2组。Ⅰ组每只小鼠脾区皮下注射6×106的HeLa细胞，Ⅱ组接种转CD59基因HeLa细胞，接种24 h后分别进行激光照射。
　　1.3 激光照射方法
　　采用氦氖激光照射器，输出功率为24 mW，能量密度为76.43 J/cm2，照射距离为50 cm，光斑直径为0.5 cm，原束照射。照射部位为脾区(瘤区)，每日照射激光1次，每次10 min共15 d，实验第16天处死小鼠。
　　1.4 Fas、bcl2、NFκB蛋白免疫组织化学检测
　　检测步骤按试剂盒说明书操作。
　　1.5 结果判定
　　免疫组化染色胞浆或（和）胞膜呈棕黄色为阳性结果。参照文献[3，4]的方法，随机选取5个高倍视野（400倍），首先根据阳性细胞所占的百分比记分，阳性细胞数&<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。再根据阳性细胞显色强度记分：无着色为0 分，轻度染色为 1 分，中度染色为2 分，重度染色为 3 分，两者得分之和即为阳性蛋白表达结果，其中&<1 分为阴性，2～3 分为弱阳性（+），4～5分为中等阳性（），6～7 分为强阳性（）。
　　2 结　　果
　　2.1 两组成瘤率及肿瘤质量比较
　　Ⅰ、Ⅱ组小鼠的成瘤率分别为87.5%、81.1%，瘤块的质量分别为(0.848±0.047)g、（1.239±0.058）g，两组的瘤质量比较差异有显著意义（t=9.169，P＜0.05）。
　　2.2 两组肿瘤组织中Fas、bcl2、NFκB蛋白表达
　　Fas、bcl2蛋白的表达定位于胞膜及（或）胞浆，阳性细胞多为弥漫分布，少数呈局灶性分布，其中两组Fas蛋白阳性染色程度无明显差别（图1、2）；Ⅱ组bcl2蛋白阳性染色程度较Ⅰ组明显加深（图3、4）。NFκB蛋白的表达定位于胞核，阳性细胞的表达呈片状或簇状分布，Ⅱ组染色程度较Ⅰ组明显加深（图5、6）。
　　图1 Fas在Ⅰ组肿瘤组织中表达 免疫组织化学染色×100 图2 Fas在Ⅱ组肿瘤组织中表达 免疫组织化学染色×100 图3 bcl2在Ⅰ组肿瘤组织中表达 免疫组织化学染色×100 图4 bcl2在Ⅱ组肿瘤组织中表达 免疫组织化学染色×100 图5 NFκB在Ⅰ组肿瘤组织中表达 免疫组织化学染色×100 图6 NFκB在Ⅱ组肿瘤组织中的表达 免疫组织化学染色×100
　　2.3 Fas、bcl2、NFκB蛋白在肿瘤细胞中表达的比较
　　在肿瘤组织中，Ⅱ组Fas蛋白的表达与Ⅰ组比较无显著差异（Z=－0.643，P＞0.05），而Ⅱ组bcl2、NFκB的表达较Ⅰ组显著升高(Z=－2.328、-2.367，P＜0.05)。见表1。表1 两组肿瘤组织Fas、bcl2、NFκB蛋白表达的比较

　　3 讨　　论
　　Fas、bcl2、NFκB基因是与细胞凋亡相关的信号分子。免疫细胞具有Fas配体，其可与肿瘤细胞Fas结合，通过激活caspase引起细胞凋亡[5]。bcl2基因在细胞抗凋亡中扮演重要角色，主要通过以下几种方式发挥抗凋亡作用:①bcl2基因能与细胞中bax基因结合，这种结合对bcl2基因抗凋亡起重要调控作用，其比值决定了细胞接受凋亡信号后的存活与否，如果bax基因占优势时细胞死亡，而bcl2基因占优势时细胞生存。②凋亡中DNA的消化需要相关的Ca2+依赖性核酸内切酶的参与，而bcl2基因也可以阻断Ca2+从内质网的释出，使依赖于Ca2+的核酸内切酶活性降低，从而阻断细胞凋亡。③bcl2基因是通过调节抗氧化途径来抑制细胞凋亡[6，7]。近年来发现，NFκB的激活可以促进肿瘤的生长，在肿瘤的治疗中是研究的热点，其具体机制尚在探讨中[8，9]。CD59是补体终末段的一种调节蛋白，它具有抑制膜攻击复合物形成，保护正常组织免受补体溶解的作用。近年来，国外报道已在多种实体瘤细胞中，如子宫内膜癌、前列腺癌、黑色素瘤及肠道肿瘤等发现有CD59分子的过表达，并与肿瘤细胞的抗凋亡及肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关[10，11]。因此，CD59分子已逐渐成为研究肿瘤细胞抗凋亡、逃逸自身免疫监视及肿瘤导向治疗中新的热点。
　　本研究旨在探讨肿瘤细胞表面CD59表达对HeNe激光杀伤肿瘤效应的影响。结果显示，Ⅰ组瘤质量及bcl2、NFκB蛋白的表达较Ⅱ组明显减少，差别有显著意义；Ⅰ组Fas表达与Ⅱ组比较差别无显著意义。这表明肿瘤细胞表面高表达CD59可以促进肿瘤细胞抗凋亡信号的形成，抑制肿瘤细胞的凋亡，拮抗HeNe激光杀伤肿瘤的效应，此结果与国内外报道一致。
　　总之，本研究从新的角度证实了CD59具有拮抗肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞生长的作用。
【参考文献】
[1]FONSATTI E， ALTOMONTE M， CORAL S. Emerging role of protectin (CD59) in humoral immunotherapy of solid malignancies[J]. Clin Ter， 2000，151(3):187193.

[2] 李冰，张学成，高美华. 藻蓝蛋白对Hela细胞CD59基因表达调控作用的研究[J]. 高技术通讯， 2006，16(2):196200.

[3]FROMWITZ F V B， VIOLA M V， CHAO S， et al. Ras P21 expression in the progression of breast cancer[J]. Human Pathol， 1987，18:12681271.

[4]姚济芬，郑伟，石一复，等. 血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶MMP2，MMP9在子宫颈癌中的表达的免疫组化研究[J]. 中国实验诊断学， 2002，6(2):7275.

[5]HERR I， DEBATIN K M. Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy[J]. Blood， 2001，98(9):26032614.

[6]CHEUNG H H， ARORA V， KORNELUK R G. Abnormalities of cell structures in tumors: apoptosis in tumors[J]. EXS， 2006(96):201221.

[7]陈燕，郭云良. 脑缺血再灌注后神经细胞bcl2 和p53 mRNA 的表达[J]. 青岛大学医学院学报， 2002，38(2):124126.

[8]LIANG Y， ZHOU Y， SHEN P. NFkappa B and its regulation on the immune system[J]. Cell Mol Immunol， 2004，1(5):343350.

[9]BUBICI C， PAPA S， PHAM C G， et al. The NFkappa Bmediated control of ROS and JNK signaling[J]. Histol Histopathol， 2006，21(1):6980.

[10]尉国昌，江富川，刘成玉，等. 急性心肌梗死病人补体活化片段浓度的动态变化[J]. 齐鲁医学杂志， 1999，14(2):9192.

[11]GORTER A， MERI A. Immune evasion of tumor cells using membranebound complement regulatory proteins[J]. Immunol Today， 1999，20(12):576582.