褪黑素对庆大霉素急性肾损伤保护作用的分析

【摘要】 目的 观察褪黑素（MLT）对庆大霉素（GM）所致大鼠急性肾损伤的保护作用，并探讨其可能的机制。方法 将24只Wistar大鼠随机分为GM组、GM+MLT组 、对照（Cont）组。应用药物前后，分别记录并观察各组大鼠体质量和24 h尿量的变化；检测并观察用药后第5天血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、尿N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶（NAG）以及血清、组织匀浆中丙二醛（MDA）、过氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSHPx）各指标的变化；处死大鼠后经肉眼观察和光镜检查肾组织的形态学变化。结果 3组大鼠的肾组织形态学评分比较，差异有显著性；GM+MLT组血BUN、Cr，尿NAG以及血清、组织匀浆中MDA、SOD、GSHPx各指标与GM组比较差异有显著性（t=-10.41～9.55，P&<0.01）。结论 MLT可通过抗氧化作用减轻庆大霉素对肾脏的损伤，对急性肾损伤具有一定的保护作用。
【关键词】 褪黑素 庆大霉素 肾小管坏死 急性 大鼠
［ABSTRACT］ObjectiveTo study whether melatonin possesses protective effects on gentamicininduced acute renal injury and approach its possible mechanism.MethodsTwentyfour adult Wistar rats were randomly pided into three groups: GM group， GM+MLT group and Control group. The weight and urine volume were recorded before and after the experiment. Blood urea nitrogen (BUN)， serum creatinine (Cr)， the level of malondialdehyde (MDA) in serum and renal tissue， the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSHPx) in serum and renal tissue were measured before and five days after gentamicin and melatonin were administered. Renal histomorphological changes were observed through naked eyes and microscopically after the mice were sacrificed. ResultsThe difference of histological grading of kidney between the three groups was significant. The levels of BUN， Cr， MDA， SOD and GSHPx between the GM group and GM+MLT group were significantly different (t＝-10.41-9.55，P&<0.01）. ConclusionMelatonin provides certain protection against gentamicininduced acute renal injury. The antioxidative functions of melatonin might be involved in the protective effects.
　　［KEY WORDS］melatonin; gentamicin; kidney tubular necrosis， acute; rats
　　庆大霉素（GM）作为氨基糖甙类抗生素，具有抗菌谱广、疗效较可靠、价廉等优点，临床广泛应用于革兰阴性菌、肠球菌及分支杆菌感染治疗[1]。有文献报道应用GM治疗后7 d以上有10％～20％病人出现急性肾衰竭[2]，增加了治疗风险及治疗成本，极大地限制了GM的应用。因此，对GM肾毒性的机制及防治方法的研究具有重要的临床意义。褪黑素（MLT）是由松果体合成分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，具有很强的抗氧化作用。实验研究表明，MLT对毒物或其他因素所致的急性肝、脑损伤有一定的保护作用[3，4]。本实验通过形态学和功能学研究，探讨MLT对GM所致急性肾损伤的保护作用及其可能的机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物及分组
　　健康成年Wistar大鼠（购于青岛市实验动物中心）24只，雌雄各半，体质量180～220 g。随机分为GM组、GM+MLT组、对照（Cont）组，每组8只，雌雄各半。于实验前1周分别将其单独饲养于金属代谢笼中，给以充分的标准饲料、水及自然光。
　　1.2 实验方法
　　GM组：每次将GM（青岛国风制药厂提供，批号H37021973）70 mg/kg皮下注射，每天2次，共4 d；GM＋MLT组：GM剂量及注射方法同GM组，在皮下注射GM前给予MLT（由Sigma公司提供）5 mg/kg腹腔注射，每天1次，共4 d；Cont组： 用等量生理盐水代替GM和MLT，分别经皮下和腹腔注射，共4 d。
　　分别于注射药物前1 d及实验第5天称取并记录每只大鼠的体质量，同时记录24 h尿量。实验第5天在收集24 h尿液后，行乙醚吸入麻醉摘眼球取血，颈椎离断处死大鼠，解剖取肾，左肾用40 g/L的甲醛固定，常规石蜡切片及苏木精伊红染色，右肾用于制备100 g/L肾组织匀浆。
　　1.3 各指标的检测方法
　　应用全自动生化分析仪分别测定血清中尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）的含量。采用南京建成生物工程研究所提供的相应试剂盒检测尿N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶（NAG）的活性和血清、肾组织匀浆中丙二醛（MDA）的含量及过氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSHPx）的活性。
　　1.4 肾组织形态学观察
　　采用HOUGHTON等[5]的方法观察切片，将病变分为0～4级。0级：肾组织结构无异常；1级：肾小管上皮细胞局灶性颗粒空泡变性，小管腔中出现颗粒状碎屑，有或无小灶状上皮脱落（&<1％的肾小管出现上皮脱落）；2级：1%～50％的皮质肾小管出现上皮坏死及脱落；3级：&>50％的近端小管出现上皮坏死及脱落，但易见到完好的近端肾小管；4级：完全或几乎完全的近端小管坏死。
　　1.5 统计学处理
　　组织学分级比较用等级分组秩和检验，其余各组数据用±s表示，应用SPSS 11.5统计学分析软件对所得数据进行统计学处理。
　　2 结　　果
　　2.1 大体观察
　　实验期间各组大鼠均无死亡。GM组及GM+MLT组动物精神较萎靡、进食减少，皮毛光泽度较差，未见腹泻。GM组和GM+MLT组大鼠肾脏较Cont组颜色浅红，水肿较明显。
　　2.2 各组大鼠体质量和尿量的变化
　　用药后，GM组和GM+MLT组大鼠的体质量明显下降（t＝4.95、5.40，P&<0.01），24 h尿量则明显增多（t＝-5.43、-4.57，P&<0.01），而Cont组体质量和24 h尿量均无明显变化。见表1。表1 各组大鼠用药前后体质量及尿量的变化
　　2.3 各组大鼠肾功能指标和尿NAG的变化
　　GM组和GM+MLT组大鼠血BUN、Scr和尿NAG与Cont组比较均有显著性升高（t＝－22.37～－6.15，P&<0.01），且GM组和GM+MLT组相比也有显著意义（t＝3.91～9.55，P&<0.01）。见表2。表2 各组大鼠血BUN、Cr含量及尿NAG活性变化
　　2.4 各组大鼠肾组织氧化活性物质及氧自由基清除酶的变化
　　与Cont组比较，GM组大鼠肾组织氧化活性物质MDA的含量明显升高，氧自由基清除酶SOD、GSHPx的活性显著下降，二者比较差异有显著性（t＝－8.35～15.53，P&<0.01）；GM+MLT组与GM组比较，MDA含量显著减少，SOD、GSHPx活性升高（t＝－10.41～5.23，P&<0.01）。见表3表3 各组大鼠血清和肾组织匀浆中MDA、SOD、GSHPx含量的变化
　　2.5 组织形态学改变
　　在光学显微镜下，Cont组大鼠肾脏的组织形态结构均正常（图1），组织形态学评分均为0级；GM组和GM+MLT组大鼠均为近端肾小管上皮细胞坏死、脱落，肾小管腔内可见蛋白管型。GM+MLT组大鼠病变较GM组轻，其肾组织形态学评分大部分为2级，1%～50％的近端肾小管出现上述病变（图2）；GM组大鼠评分大多为4级，几乎全部的近端小管有坏死脱落（图3）。3组大鼠肾组织形态学分级比较差异有显著性。
　　3 讨　　论
　　3.1 GM的肾损伤作用及其可能的机制
　　本实验中GM组和GM+MLT组的形态学和功能学检查显示符合GM急性肾损伤动物模型[6]。GM组BUN、Sr明显增高，且用药后24 h尿量明显增多，证实GM所致急性肾衰竭为非少尿型；光镜下可观察到近端肾小管上皮细胞广泛坏死脱落，而肾小球、远端小管和集合管在实验中无明显变化，这与相关实验中的电镜观察是一致的[6]，证实损伤部位主要位于近端小管。NAG是一种酸性水解酶，主要存在于近端小管上皮细胞的溶酶体内，尿中NAG活性增高与近端小管的大量坏死相符合，损伤越重，NAG越高。
　　GM急性肾损伤的机制主要有：线粒体损伤、溶酶体损伤、Na+K+ATP酶受抑制和氧化应激损伤等，其中氧化应激与GM急性肾损伤的关系密切。有关实验研究表明氧自由基的产生参与GM的肾毒性损伤[7]，此时肾皮质内脂质过氧化物及线粒体内过氧化氢明显增多[8，9]，并且XUEHAI等[10]研究显示应用羟自由基清除剂能明显减轻GM所致肾损害。本实验中GM组血清和组织匀浆中脂质过氧化产物MDA含量明显增加，而氧自由基清除酶SOD、GSHPx的活性明显降低，也提示氧化应激参与GM急性肾损伤。

　　3.2 MLT对GM肾损伤保护作用及其可能机制
　　1958年，由LERNER等首先从牛的松果体中分离得到MLT。MLT是一种吲哚类神经内分泌激素，通过与特异的受体结合发挥其生物学作用。其受体除主要存在于大脑皮质、下丘脑、垂体等部位外[11]，在外周器官还存在于肾、脾、胸腺、淋巴结、性腺、胃肠道等部位。研究显示，MLT具有较强的抗氧化性能，对氧化应激所致的急性肝、脑损伤具有保护作用[3，4]。
　　本实验通过GM组和GM+MLT组形态学和功能学检查结果的比较，提示MLT对GM所致急性肾损伤有一定的保护作用。应用MLT后，光镜下观察到近端肾小管上皮细胞的坏死较GM组轻，组织分级较好；肾功能指标血BUN、Cr和尿NAG较GM组明显下降；氧化活性物质MDA的含量减少，自由基清除酶SOD、GSHPx的活性增强。
　　反应性氧代谢产物（包括自由基）是GM急性肾损伤的主要原因之一，其中关系最密切的是羟自由基（-OH）和脂质过氧化自由基（LOO－）。-OH介导了绝大部分的氧化性损伤，而LOO－可导致自由基链式反应，扩大损伤。MLT作为一种强效抗氧化剂，在侧链N乙酰基的协同作用下，利用5位上的甲氧基可直接清除机体内各种氧自由基及活性产物，如羟自由基、脂质过氧化物、过氧化氢以及超氧负离子等。本实验中应用MLT可使血清和肾组织匀浆中的脂质过氧化产物MDA较GM组明显下降，说明MLT对GM所致大鼠急性肾损伤有明显的抗氧化作用。
　　机体为了防御自由基的损伤本身还存在抗氧化防御系统，其中包括一些自由基清除酶，如SOD、GSHPx、CAT等。研究显示，MLT能明显提高鸡脑组织中GSHPx的活性[12]。分子水平研究也表明，外源性MLT可改变抗氧化酶的基因表达，提高大鼠脑皮质中SOD和GSHPx的mRNA水平[13]。本实验中，GM+MLT组SOD和GSHPx的活性较GM组明显升高，也提示MLT通过激活自由基清除酶的活性起到抗氧化保护作用。
　　MLT其他的相关实验研究提示，其通过抗氧化作用对多种物质的氧化损伤起到保护作用。如DANIELS等[4]在研究中显示，预防性地给予MLT能阻止四氯化碳诱导的大鼠肝脏脂质过氧化损伤；
　　3期冉雯雯，孙显露，朱宗令，等. 褪黑素对庆大霉素急性肾损伤保护作用的研究195
　　KACMAZ等[14]研究也显示，MLT对于缺血再灌注引发的氧化应激损伤具有抗氧化保护作用；此外研究还显示，MLT对于烧伤后内脏组织的氧化应激损伤也有明显的抗氧化保护作用[15]。
　　本实验提示，MLT可通过直接中和自由基和激活自由基清除酶等间接抗氧化作用对GM急性肾损伤起到一定的保护作用，这为MLT在将来可能的临床应用打下了一定的基础。

参考文献

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