非小细胞肺癌肺耐药有关蛋白定量浅析及其临床意义

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【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织肺耐药相关蛋白（LRP）表达及其临床意义。方法 应用组织芯片技术结合免疫组化PV9000二步法检测术前未经化疗的72例NSCLC组织中LRP的表达，并采用图像分析技术进行定量测定。结果 LRP主要在NSCLC的细胞浆表达，细胞膜有少量表达，总阳性表达率为77.78％。LRP表达强度与组织学类型有关，在腺癌中阳性颗粒的平均吸光度与积分吸光度均高于鳞癌(t=6.977、6.114，P&<0.001)；LRP表达强度与肿瘤细胞分化程度有关，随分化程度的降低平均吸光度与积分吸光度均降低（F=4.717、5.324，P&<0.05）；其表达强度与临床分期、有无淋巴结转移、肿瘤大小及年龄无关（F=1.901、2.165，t=0.837～2.165，P&>0.05）。结论 检测LRP在NSCLC组织中的定量表达，能准确地反映NSCLC组织的耐药性及对化疗的敏感性，在指导肿瘤化疗方面具有重要的临床意义。
【关键词】 肺耐药相关蛋白 癌 非小细胞肺 组织学技术
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expression of lung resistancerelated protein (LRP) in nonsmall cell lung cancer (NSCLC) and its clinical significance. MethodsNSCLC specimens (n=72) were examined by the combined techniques of tissue chip and immunohistochemistry. The expression of LRP was quantitatively assessed by computer image analysis system. Chemotherapy was not performed in all cases before surgery. ResultsExpression of LRP was found mainly in the cytoplasm of NSCLC， few in cellular membrane. The total positive rate of LRP expression was 77.78％. The intensity of LRP immunostaining was related to the tissue type and differentiation of the cancer. The average density and accumulated density of LRP were higher in adenocarcinoma than in squamous cell carcinoma （t=6.977，6.114；P&<0.001）， and higher in well differentiation group than in poor differentiation group （F=4.717，5.324; P&<0.05）. They were not related to the clinical stage， lymph node metastasis， patients age or tumor size （F=1.901，2.165;t=0.837-2.165；P&>0.05）. ConclusionQuantitative analysis of LRP expression in NSCLC can well reflect the drug resistance of NSCLC and predict the sensitivity of cancer to chemotherapy. It is of clinical significance to guide the chemotherapy.
　　［KEY WORDS］lung resistancerelated protein; carcinoma， nonsmall cell lung; histological techniques
　　肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率近年来也呈迅速上升趋势。在我国一些大城市，其发病率占成年人恶性肿瘤发病率的第一位，已经成为人类因肿瘤致死的首位病因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的75%～80%。NSCLC单纯手术治疗效果不佳，5年生存率平均只有50％左右。目前多采用手术与放、化疗结合的综合治疗方案，化疗仍是肺癌主要的治疗手段之一［1］。肿瘤细胞产生的耐药性是影响化疗效果最常见而又最难解决的问题。已有许多研究表明，肺耐药相关蛋白(LRP)过度表达与肺癌化疗耐药密切相关［2］。检测LRP在NSCLC组织中的表达，以往多采用定性的方法，而检测其定量表达目前未见报道。本研究应用组织芯片及免疫组织化学技术结合形态学计量，检测LRP在NSCLC组织中的定量表达，探讨其与NSCLC生物学行为的关系，预测肿瘤对化疗的敏感性，从而指导肿瘤化疗。
　　1 材料和方法
　　1.1 标本来源
　　收集青岛大学医学院附属医院2003～2005年经病理证实的非小细胞肺癌手术标本共72例，均为石蜡包埋标本，术前病人未进行化疗，其中年龄&<60岁35例，≥60岁37例；肿瘤直径≤3 cm组30例，&>3 cm组42例；鳞癌30例，腺癌42例；淋巴结转移组39例，淋巴结无转移组33例；高分化组16例，中分化组26例，低分化组30例；按临床分期(1997年肺癌国际分期修正系统):Ⅰ期29例，Ⅱ期19例，Ⅲ期24例。复习全部病例的临床病理资料及苏木精伊红染色切片，每例标本选取癌组织典型代表区域，直径约2 mm，制作成2枚组织芯蜡块。
　　1.2 免疫组织化学染色
　　鼠抗人LRP单克隆抗体、PV9000检测试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。4 μｍ厚组织芯石蜡切片脱蜡，系列乙醇水化至蒸馏水，体积分数为0.03的过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，微波修复，采用免疫组织化学PV9000二步法染色，用DAB显色。切片不进行复染。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的阳性切片作为阳性对照。
　　1.3 结果判定及形态学计量
　　以肿瘤细胞质和(或)细胞膜出现棕黄色颗粒着色为阳性。应用Simple PCI多功能真彩色病理图像分析系统对免疫组织化学染色后的病理图像进行定量分析。每例标本在400倍视野下随机选取100个阳性肿瘤细胞，测定其阳性颗粒的平均吸光度和积分吸光度，以此代表阳性肿瘤细胞内LRP的相对含量。
　　2 结　　果
　　2.1 LRP在NSCLC组织中的阳性表达
　　LRP在多数肿瘤细胞质和(或)细胞膜呈棕黄色颗粒着色，以细胞质着色为主。总阳性表达率为77.78％。
　　2.2 LRP在NSCLC组织中的表达水平与生物学行为的关系
　　LRP在NSCLC组织表达水平与组织学类型有关，在腺癌中阳性颗粒的平均吸光度与积分吸光度均高于鳞癌(t=6.977、6.114，P&<0.001)；LRP与肿瘤分化程度有关，高分化组平均吸光度与积分吸光度均高于中、低分化组（F=4.717、5.324，P&<0.05）；在不同临床分期、有无淋巴结转移、肿瘤大小及年龄组之间，平均吸光度与积分吸光度差别无统计学意义（t=0.837～2.165，P&>0.05）。见表1。
　　3 讨　　论
　　化疗在NSCLC的治疗中占有重要地位，但肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性是导致化疗失败的主要原因。已知LRP与NSCLC化疗耐药密切相表1 LRP在NSCLC组织中的表达情况关。LRP作为人体的主要穹隆蛋白，广泛分布于细胞器上。LRP在肿瘤耐药中的作用需依赖ATP提供能量，使肿瘤细胞内药物外排而降低药物浓度引起肿瘤耐药，其主要通过两种机制:一方面是使以细胞核为靶位的化疗药物不能进入细胞核，或把已进入细胞核的药物转运到细胞质;另一方面是把细胞质中的药物转运到囊泡，再经胞吐机制排到胞外［3］。有研究表明，LRP的表达与NSCLC化疗耐药密切相关，其在NSCLC组织中的表达水平可反映肿瘤组织对化疗的敏感性［4］，且其高表达与NSCLC化疗耐药及预后不良密切相关［5］。

　　本实验研究表明，LRP在NSCLC组织中的表达水平与组织学类型有关，在肺腺癌中的表达强度较鳞癌高，这与临床上肺鳞癌较腺癌对化疗敏感、疗效较好相一致。另外，NSCLC中LRP在高分化组中的表达强度高于中、低分化组，且随着肿瘤细胞分化程度的降低而表达降低，这与以往单纯定性检测耐药蛋白结果不同。以往有学者采用数阳性细胞个数计算阳性率的方法进行研究，发现低分化组LRP表达阳性率高于高、中分化组［6］。而本研究应用图像分析结合组织芯片技术，采用阳性颗粒平均吸光度与积分吸光度代表阳性细胞内LRP的相对含量，发现高分化组LRP表达强度明显高于中、低分化组，这与临床高分化癌对化疗较不敏感相一致，说明蛋白定量分析比计数阳性细胞个数、阳性率能更好 地反映LRP在NSCLC组织中的表达水平。另外，LRP的表达强度与临床分期、有无淋巴结转移、肿瘤大小及年龄无关，说明临床分期、有无淋巴结转移、肿瘤大小及年龄与NSCLC化疗耐药无密切关系。与有关报道一致［7］。
　　本实验采用组织芯片技术，将数十个微小的NSCLC组织块有序地排列在一张组织芯上制成缩微组织切片，在相同实验条件及相同判断标准下，同时分析多个样本中LRP的表达情况，比传统的免疫组化方法更快速和准确。同时，采用多功能真彩色病理图像分析系统对LRP免疫组化染色后的病理图像进行定量分析，避免了由于人眼对色彩强度的主观感觉所造成的偏差。本研究结果显示，对于同是免疫组化染色阳性的肺癌细胞，一些反映着色色彩强度的指标，如平均吸光度与积分吸光度在不同组织学类型及不同分化程度之间存在着差别，这种差别单纯应用定性指标无法充分显示。因此，利用组织芯片技术与彩色病理图像分析系统结合来检测NSCLC中LRP的表达强度，能准确了解非小细胞肺癌病人的耐药情况，对于预测化疗效果、选择治疗方案具有重要的临床意义。

参考文献

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