成体半月板细胞体外分区培养分析

【摘要】 目的 分区培养成体半月板细胞，观察不同区域的半月板细胞生长特性以及生长因子对其的影响。方法 无菌切取1月龄雄性山羊双后肢半月板，剪碎后DHanks液漂洗，Ⅱ型胶原酶振荡消化，滤网过滤后离心收集细胞。接种6孔细胞培养板，每孔1×105个，37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度培养。绘制生长曲线，台盼蓝染色测细胞活力。细胞爬片行苏木精伊红及Ⅱ型胶原免疫组化染色。RTPCR检测aggrecan的表达。用流式细胞仪检测细胞周期的分布。结果 山羊成体半月板细胞自36 h后开始贴壁，外侧区细胞以长梭形为主，内侧区以多角形为主，混合区细胞形态为混合型。台盼蓝拒染试验测细胞活力约为92％。群体倍增时间约为47.4 h。加入人胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子后细胞增殖加快，多角形细胞增多；细胞爬片行Ⅱ型胶原免疫组化染色证实在转染细胞胞浆中有棕黄色颗粒。RTPCR检测结果显示目的条带与aggrecan的预期大小相符。流式细胞仪检测加入生长因子后的半月板细胞S期比例增加，而G1期细胞减少。结论 不同区域的半月板细胞有形态差异。加入生长因子后可促进其生长、增殖。
【关键词】 半月板 胫骨 胰岛素样生长因子 成纤维细胞生长因子2
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the morphology of cultured meniscal fibrochondrocytes in different areas and the influence of growth factor on the cells. MethodsThe menisci were taken from both hindlimbs of onemonthold male goat under sterile condition， cut into pieces， rinsed with DHanks， then digested with type Ⅱ collagenase. Fibrochondrocytes were collected and cultured at 37 ℃ with 5% CO2 under saturated humidity. Trypan blue stain and immunohistochemistry stain of type Ⅱ collagen were applied to determine the vitality of the cells. Reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) was used to study the expression of aggrecan and flow cytometry to analyze the distribution of the cell cycle. ResultsMeniscal fibrochondrocytes adhered to the disk 36 hours after inoculation. The peripheral cells were mostly fusiformed， the central cells polygonal and the cells in between mixed. Trypan blue failed to stain the cells. After adding hIGFⅠ and bFGF to the medium， more polygonal cells were found in the peripheral region. A flow cytometry study showed that the cell proliferation was accelerated: percentage of meniscal chondrocytes in the S stage increased， while in G1 stage decreased. Immunoreactive product of type Ⅱ collagen was detected in the cultured cells by immunohistochemistry and the existence of aggrecan band proved by RTPCR. ConclusionThe morphology of cultured meniscal fibrochondrocytes was different in different regions. The cell proliferation can be accelerated by hIGFⅠ and bFGF.
　　［KEY WORDS］meniscus， tibial; insulinlike growth factor Ⅰ; fibroblast growth factor 2
　　半月板在临床上根据血运供应、承受机械应力以及解剖部位不同分为红区、白区和红白区，虽然半月板以纤维软骨细胞为主，但考虑到其不同区域承受应力刺激以及血循环、营养来源不同，各区的细胞群体形态应该也有差异。因此，本实验对不同区域的细胞分别分离培养，观察不同区域细胞在体外单层培养条件下的形态差异，并同时观察人胰岛素样生长因子Ⅰ（hIGFⅠ）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对其生长特性的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 半月板不同区域细胞的体外单层培养
　　无菌条件下切取成年山羊半月板，无菌PBS液漂洗2次，将内1／3、中1／3、外1／3三个区域分别剪碎成1 mm3大小碎块，加入2.5 g/L胰蛋白酶和2 g/L的Ⅱ型胶原酶，37 ℃振荡消化，离心收集细胞，加入含体积分数0.10的FBS、105 U/L的青霉素钠、105 g/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞。血细胞计数板法行细胞计数后，按1×105个／孔接种于6孔板。37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度培养。隔日换液1次，用倒置相差显微镜观察细胞生长情况，当长至70％～80％融合时消化传代培养。在条件培养液中分别加入终浓度为60 μg/L的bFGF和终浓度为100 μg/L的hIGFⅠ。
　　1.2 细胞生长特性检测
　　1.2.1 台盼蓝拒染试验检测细胞活性 将细胞稀释至1×109/L，取9滴细胞悬液移入小试管中，加入1滴4 g/L台盼蓝溶液混匀。在3 min内计数活细胞和死细胞，死细胞被染成蓝色。计算活细胞率：活细胞率=（活细胞总数/计数细胞总数）×100%。
　　1.2.2 测定细胞群体倍增时间（PDT） 在接种时和接种后不同时间进行细胞计数，按下述公式计算PDT：PDT＝｛log 2/（log Ntlog N0）｝×t，其中N0、Nt分别代表接种时和培养t h后的细胞数。
　　1.2.3 生长曲线的描记 接种24孔培养板，分8组，每组3孔，每日计数1组，共8 d。以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴（对数），描绘在半对数坐标纸上，连成曲线。在曲线上细胞数量增加1倍的时间为细胞倍增时间。
　　1.3 细胞爬片苏木精伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色
　　半月板细胞传代时接种于预先放入无菌盖玻片的6孔板内，长至60％～70％融合后行苏木精伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。
　　1.4 RTPCR检测aggrecan的表达
　　TRIZOL法提取加入生长因子培养的半月板细胞的总RNA，行RNA电泳观察28S和18S rRNA的位置及形状，确定有无RNA的降解。根据GenBank公布的序列分析设计aggrecan的特异性引物。上游引物：5′CGAAACAGCCACCTCCCCAACAG3′；下游引物：5′CCCTCTGTAGCTGGGAAGGCATAAGCAT3′。RTPCR反应产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测有无目的条带出现。
　　1.5 流式细胞仪检测细胞周期分布
　　收集加入或不加入生长因子的细胞行流式细胞仪检测细胞周期的分布情况。
　　2 结　　果
　　2.1 半月板不同区域细胞的分离及体外单层培养
　　半月板细胞在接种后约36 h开始贴壁，并逐渐伸展。培养至10 d左右可长至70％～80％融合，台盼蓝拒染试验测得细胞活力在92％以上。无血运区半月板细胞以多角形软骨细胞为主，有血运区则大部分为长梭形成纤维样细胞，混合培养则两种细胞形态混合存在。3组不同区域细胞的生长速度大致相似，外侧稍快于内侧。传代后细胞贴壁速度及生长速度均高于原代细胞，细胞表型无明显改变。计算半月板细胞的PDT约为47.4 h。生长曲线描记显示，半月板细胞在经过2 d的滞留期后，开始进入对数增长期，在76 d的对数增长期内持续分裂增殖，然后转为平台期，此时细胞生长分裂渐趋稳定。加入生长因子后，外侧区半月板细胞多角形细胞所占比例增多；内侧区则多表现为细胞增殖旺盛，分裂象增多，细胞表型的改变不明显。混合区细胞表现也多为细胞分裂增殖加快。
　　2.2 细胞爬片苏木精伊红染色结果
　　细胞爬片苏木精伊红染色见胞核深染，细胞轮廓清晰，胞浆内可见颗粒，部分细胞可见明显核分裂象。Ⅱ型胶原免疫组化染色表明，在细胞浆中有大量棕黄色深染的颗粒出现。
　　2.3 RTPCR检测aggrecan的表达
　　细胞加入生长因子培养后，提取其总RNA行RTPCR，结果有约200 bp条带出现，表明有软骨细胞特异表型标记蛋白aggrecan的表达。
　　2.4 流式细胞仪检测细胞周期分布
　　传代后的半月板细胞以G1期为主，在加入生长因子培养之后，S期细胞比例增加，表明细胞生长分裂增殖活力较旺盛。
　　3 讨　　论
　　半月板的主要成分是纤维软骨细胞，其基质成分以Ⅰ型胶原为主。它在膝关节内的重要性已越来越明确并受到重视，它可以传导负荷，吸收震荡减少应力，提高关节稳定性，限制膝关节的过度伸屈，并可对关节的润滑与营养起促进作用。因此，近年来对半月板的治疗观念已经发生很大转变，修复，包括缝合、钉合和各种生物学修复成为主流方法，并显示了良好的初期疗效。

　　本实验观察到半月板不同区域培养细胞的形态、增殖特性以及对外源生长因子的反应各不相同。内侧区的半月板细胞以多角形为主，属纤维软骨细胞样表型，贴壁相对缓慢，细胞群体倍增时间也较长，分裂增殖较外侧为慢；而外侧区则以长梭形的成纤维细胞样细胞为主，贴壁迅速，细胞群体倍增时间短，分裂增殖相对旺盛。而红白交界区（中1／3段）则是两种细胞类型的混合群体，其生长特性也介于两者之间，两种细胞也遵循各自的生长特性。外侧半月板细胞对生长因子相对敏感，在增快分裂增殖的基础上，也伴有部分细胞的形态改变，如胞体增大、回缩，透亮度增加，向多角形、短梭形或椭圆形转变等。而内侧半月板细胞则仅以分裂增殖加速为主，其形态改变不明显，细胞表型基本得以保持。
　　不同区域半月板细胞的表型不同，可能与其不同部分的营养来源及承受应力差异有关。半月板内侧为无血运区，其产生能量的主要方式是无氧糖酵解，其营养主要来自滑液供应，承受的应力也是以压应力和剪切应力为主，这种环境类似于关节软骨，因此其细胞表型可能更大程度上类似于关节软骨。而外侧的营养供应除部分来自滑液外，大部分营养物质还取自血液供应，承受的应力也是以张应力为主，这种特征可能使其细胞表型更类似于与其毗邻的关节滑膜细胞或纤维组织细胞。
　　WEBBER等［2］在体外培养半月板细胞时发现其对培养液的种类较敏感，以DMEM培养时为多角形，以HAMs F12培养液培养则为线形。年龄与性别并不影响细胞单层培养的性质。本实验应用DMEM培养液培养仍观察到半月板外侧区细胞呈成纤维细胞样表型，并未检测到不同培养液对细胞表型有何影响。
　　hIGFⅠ是胰岛素样生长因子家族中的重要成员，也是其中生物学活性最强和研究最充分的成员。hIGFⅠ具有非常广泛的生物学活性，对于骨细胞和成骨细胞具有中等促进有丝分裂的作用，可以促进成骨细胞的分化、增殖与募集，促进成骨细胞的胶原、骨钙素的合成以及对磷的吸收和氨基酸的运输［3］。hIGFⅠ也可刺激DNA和蛋白聚糖的合成，加速细胞分化增殖，并可提高细胞成熟度，对软骨基质合成和稳定也起着关键作用［4］。bFGF是重要的有丝分裂促进分子，也是形态发生和分化的诱导因子，在正常生理及病理过程中参与生长发育和组织损伤的修复过程。在研究的所有生长因子中，bFGF被认为是对软骨细胞作用最强的有丝分裂原，可刺激蛋白聚糖及胶原的合成［5］。BOLANDER等［6］发现，bFGF可直接刺激体外培养的成软骨细胞的增殖并分化为软骨细胞或者使其本身数量增加。同时，KATO等［7］也证实，bFGF可促使软骨细胞合成及释放硫酸软骨素糖蛋白和Ⅱ型胶原，使细胞外基质增多。软骨细胞本身可分泌bFGF，不仅具有促进细胞增殖的作用，同时还可以使增殖的细胞稳定地向成熟软骨细胞分化。
　　本实验结果显示，加入两种生长因子后，可对不同区域半月板细胞产生较明显的影响，细胞分裂增殖加快，表现为细胞群体倍增时间缩短，细胞分裂象比例增多，在高倍镜下可见许多细胞明显的有丝分裂象。转染后S期细胞比例也相应升高，表明细胞的DNA及蛋白质等的合成功能也较旺盛，外侧区半月板细胞生长加快，部分细胞形态发生变化，胞体增大，多角形细胞所占比例增多。内侧区则多表现为细胞增殖旺盛，分裂象增多，细胞表型的改变不甚明显。混合区细胞表现也多为细胞分裂增殖加快。

参考文献

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［2］ WEBBER R J . In vitro culture of meniscal tissue ［J］. Clin Orthop， 1990，252:114120.

［3］ TRIPPEL S B， CORVOL M T， DUMONTIER M F， et al. Effect of somatomedinC/insulinlike growth factor Ⅰ and growth hormone on cultured growth plate and articular chondrocytes ［J］. Pediatr Res， 1989，25:7682.

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［5］ FUJIMOTO E， OCHI M， KATO Y， et al. Beneficial effect of basic fibroblast growth factor on the repair of fullthickness defects in rabbit articular cartilage ［J］. Arch Orthop Trauma Surg， 1999，119:139145.

［6］ BOLANDER M E. Regulation of fracture repair by growth factors ［J］. Prooc Soc Exo Bio Med， 1992，200:165.

［7］ KATO Y， GOSPODAROWICZ D. Effect of extracellular matrics on proeoglycan synthesis by cultured rabbit costal chondrocyte cultures maintained in serum free medium ［J］. J Cell Physiol， 1984，120:354.

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