关于atRA对动脉内皮损伤后平滑肌细胞CDKs表达影响

【摘要】 目的 探讨全反式维甲酸（atRA）对受损大鼠主动脉内皮平滑肌细胞周期素依赖性激酶(CDKs)表达的影响。方法 77只大鼠随机分为假手术组、损伤组、atRA组，分别于术后2、7、14 d取实验动脉段，测定内膜、中膜平滑肌细胞CDK2、CDK4的表达水平。结果 损伤组CDK2、CDK4均于术后2 d在中膜表达，随后表达渐少，损伤后7 d，在内膜有表达，14 d内膜表达呈强阳性，并可见向管腔表面聚集现象；atRA组CDK2阳性表达指数较损伤组显著下降(t=4.97～17.86，P&<0.01)，CDK4阳性表达指数亦显著下降(t=5.64～20.05，P&<0.01)。结论atRA可能通过抑制CDK2、CDK4的过表达而抑制细胞周期进程，从而抑制内膜增生。
【关键词】 维甲酸 创伤和损伤 动脉 肌细胞 平滑肌 细胞周期蛋白质依赖激酶类
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of alltrans retinoic acid (atRA) on the expression of cyclindependent kinase （CDKs） after vascular injury. MethodsThe rats were randomly pided into sham operated group， injury group， and atRA group. The aortic tissues were taken on day 2， 7， and 14， respectively. Immunohistochemistry for CDK2 and CDK4 was performed at different times. Results Immunohistochemical analysis revealed expression of both CDK2 and CDK4 within the media of injured thoracic arteries at day 2. At day 7， expression of CDK2 and CDK4 declined to basal levels in the media but both were detected within the intimal lesion. By day 14， when a prominent intimal lesion formed， CDK2 and CDK4 were largely confined to the luminal surface. Less CDK2 (t=4.97-17.86，P＜0.01) and less CDK4 (t=5.64-20.05，P＜0.01) immunostaining were found in the atRA group than in the control group.ConclusionAtRA may inhibit the VSMC cell cycle by reducing the overexpression of CDK2 and CDK4 to inhibit intimal hyperplasia.
　　［KEY WORDS］tretinoin； wounds and injuries； arteries； myocytes， smooth muscle； cyclindependent kinases
　　经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后，由于动脉壁损伤及炎性反应，刺激诸多细胞因子、生长因子产生，导致血管平滑肌细胞（VSMC）增生并向内膜迁移，支架内再狭窄率可达15%～20%左右，影响PCI术后远期疗效。刺激VSMC增生的分子机制和信号传导途径是呈网络状分布的，仅抑制某一种因子并不能有效抑制VSMC增生，寻求VSMC增生最后的共同途径，才是有效抑制VSMC增生的最佳途径，细胞周期可能就是这样一种最终的共同的途径。全反式维甲酸（atRA）具有影响细胞生长、凋亡、分化与移行等广泛的生物学作用，因此亦可能对某些血管疾病有治疗价值。本文通过分析atRA对球囊损伤大鼠胸主动脉后平滑肌细胞的细胞周期素依赖性激酶(CDKs)表达的影响，探讨atRA用于防治PCI术后再狭窄的机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　atRA为上海第六制药厂产品；CDK2单克隆抗体（工作液）为美国Santa Cruz公司产品；CDK4单克隆抗体（工作液）、免疫组化通用SP试剂盒为美国ZYMED公司产品；VIDAS 21图像分析系统为德国蔡氏公司产品；自制2F球囊导管。Wistar大鼠购自北京大学心血管病基础研究所。
　　1.2 方法
　　1.2.1 动物分组 77只健康雄性Wistar大鼠，体质量350～450 g（均于术前4 d至处死给予植物油灌胃），随机分为3组。假手术组（n=11）：除不插入球囊导管外，余操作均同损伤组，术后14 d处死；损伤组：按球囊损伤术后处死时间又分为术后2、7、14 d等3个亚组，每个亚组11只；atRA组：亦分为术后2、7、14 d等3个亚组，每个亚组11只，术前4 d至处死给予atRA（30 mg·kg-1·d-1）灌胃。
　　1.2.2 动物模型制作 参照刘乃奎等［1］的方法，将大鼠用6 g/L戊巴比妥钠（5 mL/kg腹腔内注射）麻醉后，经左颈总动脉插入2F球囊导管至腹主动脉处，注入0.1 mL生理盐水扩张球囊，回拉至颈总动脉分叉处，反复3次，将导管旋转180°，再反复回拉3次，拔出导管，结扎缝合切口，常规饲养。术前1 d及术后3 d每只大鼠给予青霉素10万单位腹腔内注射预防感染。
　　1.2.3 标本制备 将大鼠处死后，快速摘取胸主动脉，连续剪取3段2.5 mm长的血管，去除外膜内疏松结缔组织，置于中性甲醛缓冲液固定24 h，经石蜡包埋，5 μm厚连续切片，每段血管标本取3张切片，采用SP法，严格按照试剂盒操作步骤分别进行CDK2、CDK4免疫组化染色。光镜下观察免疫组化切片，胞核呈棕色为阳性。每只大鼠每个指标观察9张切片，VIDAS 21图像分析系统随机测量每张切片中10个视野(400倍)阳性细胞的平均吸光度及平均阳性细胞百分率，取其均数，用两者乘积再乘以100作为阳性表达指数，来表示蛋白质的表达水平。
　　1.2.4 统计学分析 数据以±s表示，采用SPSS 11.0统计软件分析。组间比较采用t检验。
　　2 结　　果
　　假手术组CDK2、CDK4表达均呈阴性反应。损伤组CDK2、CDK4均于术后2 d在中膜散在阳性表达；术后7 d，CDK2、CDK4在新生内膜呈阳性表达，中膜则少或无表达；术后14 d，CDK2、CDK4随内膜进一步增厚均呈强阳性表达，且有向管腔表面聚集的趋势。atRA组与损伤组比较，中膜（2、7 d）或内膜（7、14 d）CDK2的阳性表达均明显减少(t=4.97～17.86，P&<0.01)；CDK4的阳性表达亦均明显减少（t=5.64～20.05，P&<0.01）。见表1。表1 atRA对球囊损伤大鼠胸主动脉内皮后平滑肌细胞CDKs阳性表达指数的影响与损伤组相应时间比较，*t=4.97～17.86，P&<0.01；△t=5.64～20.05，P&<0.01
　　3 讨　　论
　 血管内皮损伤后，VSMC向内膜的迁移、增生是再狭窄的主要病理机制［2，3］。抑制平滑肌细胞增生和向内膜迁移是预防血管成形术后再狭窄的重要手段。
　　CDKs是一种蛋白激酶家族，是细胞周期调节重要分子，它们通过磷酸化脱磷酸化调节一系列靶分子的活性，最终导致DNA的复制和有丝分裂。研究发现，atRA能维持并诱导VSMC处于较高水平的分化状态，抑制VSMC迁移和增殖［4］。CDKcyclin复合物的周期性聚集、激活和解聚可驱动细胞周期运转，CDK是复合物的催化亚基，而cyclin是调节亚基。cyclinECDK2、cyclinACDK2和cyclinDCDK4共同参与G1期和S期的视网膜母细胞瘤基因(Rb)磷酸化，使E2F释放，增加转录RNA的速度，促进细胞由G1期向S期过渡［5］。KOSOKA等［6］采用细胞培养研究发现，atRA对cyclinE、cyclinD3、CDK4、CDK6、CDK2等多种基因有抑制作用，从而抑制细胞周期进程。刘国霞等［7］应用免疫组化和电子显微镜观察的方法研究atRA对原代培养的人腹主动脉VSMC增殖的影响，发现atRA使VSMC的增长速度减慢，经atRA处理的细胞中cyclinD1、CDK4的表达分别降低了39%和38%，cmyc基因的表达水平降低了43.6%。

　　本实验结果显示，CDK2、CDK4在正常动脉壁血管组织中表达量甚微或无；球囊损伤术后2 d其均呈阳性反应，阳性细胞在中膜散在表达；术后7 d新生内膜形成，均在内膜表达，中膜则少或无表达；术后14 d随内膜进一步增厚，表达局限于内膜，均呈强阳性，且有向管腔表面聚集的趋势，这与WEI等［8］的报道相一致。其变化规律与形态学表现相一致，说明CDK2、CDK4的表达是对球囊损伤的一种反应，CDK2、CDK4的过度表达及其对细胞周期的影响是发生再狭窄的机制之一。atRA使中膜（2、7 d）和内膜（7、14 d）的CDK2、CDK4阳性表达均明显少于损伤组，说明atRA可能通过抑制G1期CDK2、CDK4的表达而影响CDK4与cyclinD的结合，影响CDK2与cyclinD、cyclinE在晚G1和早S期的结合，从而抑制G1→S期进程；通过抑制S期CDK2的表达，影响CDK2与cyclinA在S期的结合，从而抑制DNA的合成。
　　CDK2可作为血管成形术后再狭窄防治中的靶基因［8］。MORISHITA等［9］合成了CDK2的反义寡核苷酸，以病毒HVU脂质体为介导，转染到大鼠损伤颈动脉，转染2周即发现内膜增生被显著抑制（抑制率达60%）。SUZUKI等［10］亦证实HVJ脂质体介导的CDK2反义寡核苷酸对移植冠状动脉内膜增生有抑制作用。TAKAGI［11］发现，腺病毒诱导的CDK抑制物p57kip2的过度表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖，且VSMC大部分停留在G1期，亦提示CDKs可作为血管成形术后再狭窄防治中的靶基因。
　　然而，单独针对细胞周期调节因子的治疗可能并不能治疗人类复杂的血管栓塞性疾病，仍需从不同的角度进一步研究、探讨维甲酸对PCI术后再狭窄的防治作用及其机制。

【参考文献】
［1］ 刘乃奎，岑链珍，唐朝枢，等. 大鼠胸主动脉内皮剥脱后血管的钙稳态变化［J］. 中国病理生理杂志， 1995，11（5）：479.

［2］ MOUNTFORD J C， VANIN E F， HAYDEN R E， et al. Alltrans retinoic acid increases transgene expression in MSCVtransduced cells， via a mechanism that is retinoid receptor dependent but independent of cellular differentiation［J］. Hum Gene Ther， 2005，16(1):132.

［3］ HUNGERFORD J E， LITTLE C D. Developmental biology of the vascular smooth muscle cell: building a multilayered vessel wall［J］. J Vasc Res， 1999，36:2．

［4］ 褚现明，钟志欢，王国栋，等. 全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉VSMC表型变化及增殖的影响［J］. 青岛大学医学院学报， 2005，41（4）：297.

［5］ 徐松德，张建业． 医用分子生物学［M］. 北京：人民卫生出版社， 1999：205．

［6］ KOSAKA C， SASAGURI T， KOMIYAMA Y， et al. Alltrans retinoic acid inhibits vascular smooth cell proliferation targeting multiple genes for cyclins and cyclindependent kinases ［J］. Hypertens Res， 2001，24(5):579.

［7］ 刘国霞，李存玺，曾灵芳，等． 维甲酸对人腹主动脉平滑肌细胞增殖的影响［J］. 科学通报， 1998，43(21)：2286．

［8］ WEI G L， KRASIKI K， KEARNEY M， et al. Temperally and spatially coordinated expression of cell cycle regulatory factors after angioplasty ［J］. Circ Res， 1997，80(3):418.

［9］ MORISHITA R， GIBBONS G H， ELLISON K E， et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense kinase oligonucleotides ［J］. J Clin Invest， 1994，93:1458.

［10］ SUZUKI J， ISOBE M， MORISHITA R， et al. Prevention of graft coronary arteriosclerosis by antisense CDK2 kinase oligonucleotide ［J］. Nature Medicine， 1997，3:900.

［11］ TAKAGI Y. Adenovirusmediated overexpression of a cyclindependent kinase inhibitor， p57kip2， suppressed vascular smooth muscle cell proliferation ［J］. Hokkaido Igaku Zasshi， 2002，77(3):221.

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