关于外源性HPV16 E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞Cyclin E表达的影响

【摘要】 目的 研究重组腺病毒介导人乳头状瘤病毒(HPV)16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期蛋白E (Cyclin E)表达的影响，探讨HPV16 E7癌基因以及Cyclin E在宫颈癌发生发展中的作用。 方法用含有HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测感染前后Cyclin E表达的差异。结果 HPV16 E7感染后Cyclin E表达较感染前明显增加。结论 HPV16 E7基因的表达促进Cyclin E的表达，对宫颈肿瘤细胞有增殖促进的作用。
【关键词】 乳头状瘤病毒 人 基因 E7 感染 宫颈肿瘤 细胞周期蛋白E
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of Cyclin E in HeLa cells after the transfection of HPV16 E7 oncogene by recombinant adenovirus vector， and assess the effect of HPV16 E7 oncogene and Cyclin E in the development of human cervical carcinoma. MethodsExpression of Cyclin E was detected by laser scanning confocal microscope (LSCM) before and after the transfection. ResultsExpression of Cyclin E protein in the HeLa cells increased significantly after the transfection of HPV16 E7 genes.ConclusionExpression of HPV16 E7 oncogene influences the expression of Cyclin E and enhances the proliferation of the cells of cervical carcinoma.
　　［KEY WORDS］papillomavirus， human; genes， E7; infection; cervix neoplasms; Cyclin E
　　宫颈癌是女性高发恶性肿瘤，在全球女性恶性肿瘤中其发病率仅次于乳癌，在我国则居首位。人乳头状瘤病毒(HPV)的感染是宫颈癌发生发展的主要因素。HPV 16/18 DNA 的检出率在宫颈浸润癌可达90%［1］ 。HPV16型E7 (HPV16 E7)病毒癌基因被认为是潜在的致癌基因，其编码的产物可与细胞内癌基因和抑癌基因相互作用而使细胞失去正常功能，从而导致细胞恶变。细胞周期蛋白E（Cyclin E）是G1期细胞周期蛋白， 在G1晚期调控和G1/ S期转换过程中起关键作用。本研究使用腺病毒表达载体介导HPV16 E7基因在宫颈癌细胞株HeLa中表达，研究HPV16E7病毒癌基因对HeLa细胞周期蛋白Cyclin E的影响，以探讨HPV16 E7癌基因和Cyclin E在宫颈癌发生发展中的作用。
　　1 材料和方法
　　1.1 实验材料
　　含有HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒载体为我实验室所构建，并在人胚肾细胞株HEK293细胞中包装成完整腺病毒，置-80 ℃保存。所用载体为AdEasy系统，包含腺病毒骨架质pAdEasy1和穿梭质粒pAdTrackCMV，其中pAdTrackCMV中含有编码绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的基因。RPMI 1640、DMEM、血清及TritonX100均购自美国GBICO公司。宫颈癌上皮HeLa 细胞为青岛大学医学院微生物学实验室保存。Cyclin E单克隆抗体购自美国BD公司。二抗为四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC，美国VECTOR公司）标记羊抗鼠IgG。德国ZEISS公司激光扫描共聚焦显微镜（LSM510Meta ）及计算机系统。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 细胞制备 取1瓶生长至90％融合的宫颈癌细胞系HeLa，按常规方法传代培养细胞，将细胞以3 ×108/ L 浓度接种于含盖玻片的六孔板中制备细胞爬片，培养液为含体积分数0.10胎牛血清的RPMI 1640。2 d后对其中3孔细胞进行感染，另3孔仍进行常规细胞培养作为同期对照。置37 ℃、含体积分数0.05 CO2饱和湿度培养箱内培养。
　　1.2.2 含有HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒AdE7感染HeLa细胞 感染时将细胞培养液更换为无抗生素、无血清的新鲜RPMI 1640培养液（每孔1 mL），二氧化碳培养箱中孵育30 min。将病毒上清50 μL（病毒滴度3×1014pfu/L）加至1 mL的RPMI 1640培养基中，轻轻混匀，培养箱中孵育90 min后补加体积分数0.05的完全培养基。36 h后在荧光显微镜下观察GFP的表达。
　　1.2.3 免疫荧光染色检测 将细胞爬片先用预温的1 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）洗涤5 min，共3次，然后用冰冷的40 g/L多聚甲醛固定1 h。PBS 洗涤5 min，共3次，TritonX100破膜15 min，PBS洗涤后用体积分数0.10羊血清封闭30 min。在各细胞爬片上分别加入鼠抗人Cyclin E抗体（稀释浓度为1∶100)，室温孵育30 min后荧光洗液洗涤5 min，共3 次。然后分别加入TRITC标记的羊抗鼠IgG (稀释浓度1∶100)室温避光放置30 min， 荧光洗液同上洗涤。最后用无荧光的缓冲甘油封片。抗体稀释均用体积分数0.10牛血清清蛋白（BSA）溶液。感染HeLa细胞中选取一孔用PBS 置换一抗作空白对照，未感染HeLa细胞同样设置空白对照。于LSM510Meta激光扫描共聚焦显微镜下观察结果，Combi FCS LSMMETA软件进行分析。用于TRITC检测的激发光波长为543 nm，用于GFP检测的激发光波长为488 nm。
　　2 结　　果
　　感染重组腺病毒后HeLa细胞在488 nm波长激发光下胞质呈黄绿色，弥漫于整个胞质，感染率达80％。在543 nm波长激发光下Cyclin E呈鲜艳的红色阳性荧光信号，主要分布在胞核中，部分分布在细胞质。对照组荧光染色均呈阴性。
　　3 讨　　论
　　激光扫描共聚焦显微镜是近年来发展起来的一种结合激光扫描、计算机自动化分析与显微镜技术的新技术，具有图像清晰，特异性高、敏感性强的优点。由于LSCM是采取激光和被激发荧光的双重聚焦技术，焦点之外的光被挡在挡板以外且不在图像上成图，具有细胞“CT”之称。LSCM在形态学上的直观性是其他技术无法比拟的，为蛋白质表达的定位分析提供了更加丰富的生物学信息。在本实验中，利用LSCM可以直接观察绿色荧光蛋白表达情况，从而简单迅速判定感染成功与否及感染效率的高低。同时，在LSCM下直观观察红色荧光可清晰明了地判定Cyclin E的定位、定量表达情况。
　　目前普遍认为，HPV感染及其引发的抑癌基因功能丧失和细胞周期调控失调是宫颈癌发病的重要因素。 HPV 感染是导致宫颈癌发生的主要病因，HPV的致癌作用主要通过E6、E7实现［2］。研究表明，HPV16 E7基因编码的HPV16 E7蛋白能和细胞内的Rb蛋白结合释放出E2F，从而诱导细胞周期S期的相关基因表达，促使细胞进入S期。Cyclin E 是G1 期细胞周期蛋白， 作为细胞周期素依赖激酶CDK2的调节亚基，与CDK2结合成复合物进一步磷酸化pRb使之失活，并释放转录调节因子E2F；也可作用于BMyb、Rpet等转录调节因子，这些转录因子提高S 期必需基因及Cyclin A 的表达，从而调节中心体的复制，启动DNA的合成，促进细胞进入并加速S 期［3］。有文献报道，在直肠癌、乳癌、卵巢癌等多种肿瘤中Cyclin E基因扩增和表达失调。而Cyclin E在宫颈癌发生发展中所起的作用， 国内罕见报道。Cyclin E 作为G1 期的一个重要限速因子， 对其进行研究有助于揭示肿瘤细胞基本的生物特性及真核细胞周期调控机制。
　　本研究使用重组腺病毒载体介导HPV16 E7基因在HeLa细胞中表达，而HeLa细胞是HPV16阴性、HPV18阳性的宫颈癌细胞株。本实验将HPV16 E7基因通过腺病毒表达载体导入HPV16阴性的人宫颈癌HeLa细胞，以检测HPV16 E7基因对CyclinE蛋白表达的影响。结果表明，HPV16 E7的表达促进细胞周期调控蛋白Cyclin E的表达。有研究认为，HPV16 E7 蛋白可以使宫颈上皮细胞的抑癌基因产物pRb 失活，导致Cyclin E 基因高表达 ［4～6］。HPV16 E7 蛋白还可能直接与Cyclin E及Cyclin E 相关蛋白结合，抑制Cyclin E 降解［7］，确保Cyclin ECDK2复合物在整个细胞周期都具有活性［8］。另外，HPV 16 E6、E7 抑制P21、P27活性［9］，而P21、P27是目前公认的Cyclin E的细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子，所以HPV16 E7也有可能通过抑制P21、P27而使Cyclin E表达增加。　　

转贴于 本文实验结果表明，HPV16 E7基因的表达促进细胞周期调控蛋白Cyclin E的表达。Cyclin E与CDK2 形成活性复合物，参与G1 期和S 期的pRb 磷酸化作用，加速S 期，对DNA复制的启动十分重要。可以推测，HPV16 E7癌基因引起宫颈细胞恶性转化过程中，有可能通过促进细胞周期蛋白E的表达而影响细胞周期进程，导致细胞增生失控而恶性转化。HPV16 E7 癌蛋白被认为可能与肿瘤发生的早期阶段有关［10］，而Cyclin E 基因高表达出现在宫颈上皮细胞恶性转化的早期［11］ 。因而HPV16 E7癌基因促进Cyclin E表达，可能是引起宫颈上皮细胞早期发生周期蛋白失调、周期紊乱、生长失控过程中的重要一环，在诱导宫颈癌发生机制中起着关键作用。

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