线栓法制备大鼠视网膜缺血再灌注模型的初步研讨

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【摘要】 目的 建立一种理想的视网膜缺血再灌注动物模型。方法 成年Wistar大鼠20只，除2只4眼作为对照组外，余18只36眼作为实验组，分为缺血1 h组及缺血2 h组，每组9只。实验中用预先制备的线栓插入实验组大鼠颈内动脉，造成视网膜缺血，分别于缺血1、2 h后及再灌注6 h后观察眼底，术后摘除缺血1、2 h及再灌注6 h的眼球进行组织学观察。结果 实验组大鼠术后均发生视网膜缺血，视网膜苍白、水肿，以神经纤维层和内网状层最明显，可见白细胞浸润。再灌注6 h后视网膜水肿减退，神经纤维层水肿减轻，造模成功。结论 此方法比较接近视网膜缺血临床病理过程，模型稳定、可靠。
【关键词】 模型 动物 视网膜 缺血 再灌注 大鼠
　　［ABSTRACT］ Objective To establish an ideal retinal ischemiareperfusion animal model. Methods A segment of prepared thread was introduced into the carotid artery of 18 adult Wistar rats and resulted in retinal ischemia of 36 eyes， which was followed by 6 h reperfusion. Fundus changes and morphological changes of eyes were observed after ischemia and reperfusion. According to the period of ischemia， the 36 eyes were pided into two groups: group 1， having 1 h ischemia， group 2， having 2 h ischemia. Four eyes of two rats served as controls. Results The retinal ischemia resulted in retinal pallor and edema with leukocytic infiltrate， especially in nerve fiber layer and plexiform layer. After reperfusion， retinal edema and nerve fiber layer edema began to decrease. Conclusion The retinal ischemia model established in this study is similar to the natural course of clinical retinal ocular ischemia. The model is stable and reliable.
　　［KEY WORDS］ Models， animal; Retinal; Ischemia; Reperfusion; Rats
　　视网膜缺血再灌注损伤是眼科常见的病理过程，严重影响病人视功能。其发生机制十分复杂，已成为近年眼科的研究热点之一[1]。动物模型是研究视网膜缺血的重要途径之一。目前较常用的模型有两种：血管结扎模型及升高眼内压模型。理想的视网膜缺血再灌注模型应当是只阻断视网膜动脉或动静脉，而对视网膜其他部分组织没有任何损伤，而由于实验条件和技术的限制，目前尚无一种模型能够达到这一要求[2]。本实验旨在探索建立一种理想的视网膜缺血再灌注动物模型，努力使模型接近临床病理过程，为后续研究奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　健康成年Wistar大鼠（由青岛市药检所提供）20只40眼，雌雄不限，体质量220～250 g，取2只4眼作为对照组，余18只36眼作为实验组，随机分为缺血1 h和缺血2 h组，每组9只。术中所用器械为：市售普通2.0鱼线（直径0.23 mm），704硅橡胶，砂纸，眼科常用30皮肤缝线，游标卡尺，动脉夹，电凝器。
　　1.2 方法
　　1.2.1 线栓制作
　　①鱼线缠绕一约10 cm×5 cm硬性卡片，重物施压1～2 d，以使鱼线变直；②将鱼线切成4 cm长小段，一端用砂纸打磨约3～4 mm，显微镜下观察表面有凹凸感即可，以方便挂胶；③将打磨好的鱼线蘸少许硅橡胶，立即在光滑的玻璃板上打磨，使橡胶在打磨端呈半透明的圆柱状；④将制备好的线栓自然气温下晾干，游标卡尺量取1.6、1.8 cm长度并标记，挑选直径0.24～0.26 mm线栓压直过夜备用。
　　1.2.2 模型制作
　　①水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，25g/L碘附消毒颈部皮肤，颈旁偏左0.3～0.5 cm作长约2 cm纵行切口，钝性分离出颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉；②丝线结扎颈外动脉远心端，动脉夹夹闭颈总动脉近心端、颈内动脉远心端，并在颈外动脉靠近颈总动脉处预置一根缝线；③显微剪刀靠近颈外动脉结扎处近心端剪一斜口，插入线栓，打结预置缝线，不必太紧，剪断颈外动脉结扎处，向下逆转动脉，使之与颈内动脉呈一直线；④松开颈总、颈内动脉夹，同时用显微镊子向颈内动脉输送线栓到达标记点即可；⑤此时外观可见大鼠左眼苍白，与右眼对比明显，眼底镜下可见左眼视网膜水肿，苍白，实验组分别缺血1、2 h后恢复再灌注6 h；⑥将线栓头退至颈总动脉分叉处可见左眼巩膜重新恢复血供，视网膜血管充盈，造模成功。
　　1.2.3 病理片制作
　　分别在术后依照实验设计时间使用水合氯醛深度麻醉大鼠后，取对照组及缺血1 h和2 h组大鼠左眼，中性甲醛固定，乙醇梯度脱水后石蜡包埋，做5 μm厚切片，普通苏木精伊红染色，镜检。另外，术后直接取对照组一只大鼠左、右眼，做大体对照。
　　2 结 果
　　实验组18只大鼠造模成功16只，缺血1 h组1只术中出血死亡，1只术中呼吸困难死亡。从病理切片可见，与正常对照组相比，实验组大鼠视网膜缺血1 h主要表现为视网膜水肿，其中以神经纤维层和内网状层最明显，厚度增加明显，染色较淡，缺血2 h视网膜水肿加重，内核层细胞排列紊乱，可见白细胞浸润；再灌注6 h后视网膜水肿开始减退，神经纤维层水肿开始减轻，造模成功。
　　3 讨论
　　目前，通过各种实验研究探索缺血再灌注损伤机制以及减轻或防止其损伤的方法很多，但比较常用的方法有如下两种。①血管结扎模型：血管结扎最常用的方法是手术分离暴露眼球后部，用尼龙线或丝线将视网膜中央动脉、静脉，连同视神经一起结扎[3，4]。此外，也可在手术显微镜下剪开视神经鞘膜，分离出视网膜中央动脉，单独钳夹视网膜中央动脉[5]。还有同时钳夹双侧颈总动脉造成视网膜缺血者[6]，但此法对实验室及器械要求高，手术要求一定的技巧性且对大鼠损伤较大，不适合初学者实验。②升高眼内压模型:该模型是由前房刺入连有灌注瓶的灌注针头，通过升高灌注瓶的高度，使眼内压通过体循环收缩压达到一定阈值，造成整个视网膜的缺血，是目前常用的一种缺血再灌注模型[7]。此法较简单，适合初学者使用，但再灌注形成缓慢，对角膜损伤较重，角膜容易水肿，不利于眼底观察，且存在较严重的眼内感染。

转贴于 本实验采取线栓法制备大鼠缺血再灌注损伤模型，以期能在前人研究基础上，努力探索一种比较符合临床视网膜缺血病理过程的实验方法。从本实验结果来看，缺血1 h后视网膜苍白、水肿，2 h后水肿加重，内核层细胞排列紊乱，证实视网膜发生缺血，而恢复再灌注后，可见水肿开始消退，以上病理改变证实本实验方法可以模拟临床上视网膜缺血再灌注损伤过程，达到实验预期目的。但是，由于是初步探索，本实验不可避免存在着一些缺点。①术中易出血：由于大鼠颈外动脉分支较多且较细小，术中分离时容易发生出血，要注意及时电凝，避免较多出血，大量出血易导致大鼠死亡。②神经损伤：由于喉返神经及迷走神经与颈外动脉的分支联系紧密，分离时要注意防止牵拉过度或损伤，以免引起大鼠喉痉挛和呼吸心率变化，造成大鼠死亡。个人体会是实验中可以在靠近此两神经的小血管处预置牵拉缝线，分离时牵拉缝线，尽量使血管与神经分开一定距离。③缺乏一定解剖资料：对于目前尚无大鼠头颈部血管解剖文献的支持，线栓的直径和插入长度较大依赖实验者的探索，本实验所标记的线栓长度，乃预实验探索的结果。
　　综上所述，尽管本实验存在着一定的缺陷，但能较好地模拟视网膜缺血再灌注的临床过程，特别是对于眼动脉阻塞或狭窄所引起的视网膜缺血，仍具有一定的价值。其缺点尚需在以后的实验过程中继续探索并加以完善。

参考文献

　　[1]袁春燕，牛膺筠. 视网膜缺血再灌注损伤后凋亡相关基因表达的变化[J]. 青岛大学医学院学报， 2006，42(4):340344.

　　[2]丁建光，姜德咏. 视网膜缺血再灌注损伤的保护[J]. 国际眼科杂志， 2005，5(5):10101015.

　　[3]TSUJIKAWA A， OGURA Y， HIROSBIBA N， et al. Retinal ischemiareperfusion injury attenuated by blocking of adbesion molecules of vascular endothelium[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci， 1999，40(6):11831190.

　　[4]NONAKA A， KIRYU J， TSUJIKAWA A， et al. Administration of 17 betaestradiol attenuates retinal ischemiareperfusion injury in rats[J]. Invest Ophthalmo Vis Sci， 2000，41(9):26892696.

　　[5]YOKOYAMAA， OSBITARI T， NEGISHI H， et al. AdachiUsami E.Protection of retinal ganglion cells from ischemiareperfusion injury by electrically applied HsP27[J]. Invest Ophthalmo Vis Sci， 2001，42(13):32833276.

　　[6]OSBORNE N N， LARSEN A， BARNETT N L. Influence of excitatory aminoacids and ischemia on rat retinal choline acetyl transferasecontaining cells[J]. Invest Ophthalmo Vis Sci， 1995，36(8):16921700.

　　[7]NAYAK M S， KITA M， MARMOR M F. Protection of rabbit retina from ischemic injury by superoxide dismutase and catalase[J]. Invest Ophthalmo Vis Sci， 1993，34(6):20182022.