抗甲状腺药物引起Graves病病人白细胞减少与HLADRB1*08032及DRB1*1501等

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【摘要】 　　目的 探讨Graves病（GD）病人应用抗甲状腺药物(ATD)引起白细胞减少与HLADRB1*08032、DRB1*1501的相关性。方法 选择130例GD并白细胞减少病人（GDL组），其中应用ATD引起白细胞减少65例（ATDL组），未应用ATD并发白细胞减少65例（NATDL组）；非GD病人白细胞减少65例（NGDL组）；正常对照65例（CON组）。采用多聚酶链式反应序列特异引物（PCRSSP）方法检测各组HLADRB1*08032和DRB1*1501等位基因频率。结果 GDL组HLADRB1*08032的等位基因频率明显高于CON组和NGDL组（χ2=12.169，P&<0.01），ATDL组明显高于NATDL组（χ2=4.032，P&<0.05）；GDL组HLADRB1*1501的等位基因频率明显高于CON组和NGDL组（χ2=12.342，P&<0.01），ATDL组明显高于NATDL组（χ2=4.432，P&<0.05）。结论 GD病人白细胞减少与HLADRB1*08032和HLADRB1*1501的等位基因表达存在相关性，ATD导致白细胞减少与HLADRB1*08032和HLADRB1*1501的等位基因频率增加有关。
【关键词】 Graves病 抗甲状腺药 白细胞减少 HLA DR抗原 等位基因 聚合酶链反应
　　［ABSTRACT］ Objective To determine the association between HLA class Ⅱ genes and ATDinduced leucocytopenia in patients with Graves disease. Methods Recruited into this study were 130 GD patients with leukocytopenia (GDL)， 65 leucocytopeni patients without GD (NGDL) and 65 normol controls (CON). Of the 130 GD patients， 65 had ATDinduced leukicytopenia (ATDL)， the other 65 were nonATDinduced leucocytopenia (NATDL). The frequency of HLADRB1*08032 and DRB1*1501 gene expressions was examined with polymerase chain reaction based sequencespecifec primer (PCRSSP) method. Results The frequency of HLADRB1*08032 in GDL group was significantly higher than that in CON and NGDL groups (P&<0.01). The frequency of HLADRB1*08032 in ATDL group was significantly higher than that in NATDL group (P&<0.05). The frequency of HLADRB1*1501 in GDL group was significantly higher than that in CON and NGDL groups (P&<0.01). The frequency of HLADRB1*1501 in ATDL group was significantly higher than that in NATDL group (P&<0.05). Conclusion GD with leucocytopenia was associated with HLADRB1*08032 and HLADRB1*1501 gene expression. ATDinduced leucocytopenia was associated with higher expression of HLADRB1*08032 and HLADRB1*1501 gene.
　　
　　［KEY WORDS］ Graves disease; Antithyroid agents; Leucopenia; HLADR antigens; Alleles; Polymerase chain reaction
　　
　　Graves病（GD）病人应用抗甲状腺药物(ATD)治疗常见的并发症是白细胞减少，其机制不清，可能与免疫抑制、药物对骨髓毒性作用等有关。本研究应用多聚酶链式反应序列特异引物（PCRSSP）方法，对GD并发白细胞减少病人的HLADRB1*08032 和DRB1*1501等位基因进行检测，以探讨其与GD病人ATD引起白细胞减少的相关性。现将结果报告如下。
　　1 对象和方法
　　1.1 对象与分组
　　1.1.1 GDL组 并发白细胞减少的GD病人130例，来自临沂市人民医院内分泌科、血液科门诊和住院病人，其中男43例，女87例；年龄18～49岁，平均（32.0±13.8）岁。均符合GD诊断标准和白细胞减少的诊断标准[1]。按照白细胞减少是否由ATD引起再分为2个亚组。ATDL组：应用ATD后引起，共65例，其中男20例，女45例，年龄18～48岁，平均（33.0±12.5）岁，病人应用ATD前无血液系统疾病，白细胞和粒细胞正常。NATDL组：非ATD引起，共65例，其中男23例，女42例，年龄为19～49岁，平均（31.0±14.5）岁，病人于确诊GD的同时发现白细胞减少。
　　1.1.2 NGDL组 非GD白细胞减少病人65例，来自临沂市人民医院内分泌科、血液科门诊和住院病人，其中男37例，女28例，年龄28～47岁，平均（34.0±12.9）岁。查体发现白细胞减少，之前没有应用任何药物，无其他疾病。
　　1.1.3 CON组 65例，为来自临沂市人民医院健康查体中心的健康查体者，其中男30例，女35例，年龄19～50岁，平均 （35.0±16.1）岁。
　　1.2 检测方法
　　1.2.1 提取外周血白细胞基因组DNA 抽取受检者外周静脉血，采用上海飞捷生物有限公司的全血DNA抽提试剂盒提取DNA，-4 ℃存放。
　　1.2.2 HLADRB1*08032基因检测 引物序列分别为：5′ACTACTCTACGGGTGAGTGTT3′， 5′CTGCAGTAGGTGTCCACCAG3′，均由上海生工生物工程公司合成。反应条件： 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共32个循环；最后72 ℃延伸 5 min。取 PCR 产物5 μL和loading buffer 10 μL混匀，置于20 g/L的琼脂糖凝胶中，恒压（120 V）条件下电泳约 30 min后，在紫外线计算机照相装置下观察扩增结果，并拍片存档。
　　1.2.3 HLADRB1*1501基因检测 引物序列分别为：5′TCCTGTGGCAGCCTAAGAG3′， 5′CCGCGCCTGCTCCAGGATT3′，其检测参照HLADRB1*08032的检测条件。
　　1.3 统计学处理
　　
　　各组等位基因频率比较用χ2检验。统计分析采用SPSS 13.0软件处理。
　　2 结果
　　
　　GDL组HLADRB1*08032等位基因频率明显高于CON组（χ2=12.169，P&<0.01），ATDL组病人明显高于NATDL组（χ2=4.032，P&<0.05）。而GDL组HLADRB1*1501等位基因频率也明显高于CON组和NGDL组(χ2=12.342，P&<0.01），ATDL组也明显高于NATDL组(χ2=4.432，P&<0.05）。见表1。

　　3 讨论
　　表1 各组HLADRB1*08032、HLADRB1*1501等位基因分布频率（略）
　　ATD是临床上治疗GD最常用的方法，ATD引起的白细胞减少是常见的并发症，甚至可引起粒细胞缺乏，导致严重的后果。因此，研究ATD引起白细胞减少的机制，对于指导临床治疗GD时正确选择治疗方案，尽量减少或避免严重粒细胞缺乏的发生具有重要的意义。GD应用ATD时间、药物调整由复查TRAb和sTSH提供依据[2]。
　　
　　GD的发病与遗传和环境因素有密切的关系。VILLANUEVA等[3]认为有多个基因参与引起自身免疫性甲状腺疾病，即使在同一个家族中，也有多于一个的基因参与诱发自身免疫性甲状腺疾病的发生。谷奕等[4]对天津地区GD病人并发白细胞减少与基因多态性的关联性的研究认为，HLADQA1*0301可能是天津地区汉族人GD的易感基因，而HLADQA1*0201、HLADQA1*0401 则可能是其保护基因。KULA 等[5]研究了GD病人体内最常见的HLA和CTLA4两个基因位点，认为GD是由多个基因参与引起的自身免疫性疾病，而且基因之间是相互作用的，HLADRB1*03是危险基因，而HLADRB1*07则是保护基因，CTLA4虽然不是危险基因，但是它的存在，削弱了HLADRB1*07的保护作用，但对HLADRB1*03的危险作用却没有任何作用。本研究通过对GDL的HLADRB1的检测显示，GD病人出现白细胞减少者（包括GD并发白细胞减少和ATD引起者）HLADRB1*08032和HLADRB1*1501的基因频率均增加，提示HLAⅡ基因不仅与GD的发病相关，而且与其并发症也可能相关。
　　
　　日本学者TAMAIH等[6]对24例应用ATD引起白细胞减少病人，68例经ATD治疗未发生白细胞减少的病人及525例志愿者共3组人群进行了相关基因HLAⅡ型基因的研究，以多聚酶链反应序列特异性核苷酸探针方法进行HLADRB1基因分型，结果显示白细胞减少的病人与正常人及未发生白细胞减少病人相比，HLADRB1*08032等位基因频率明显升高。提示ATD导致的白细胞减少与HLADRB1*08032之间存在明显相关性。他们还认为ATD引起的白细胞减少可能与HLADRB1*1501有关，可能是由于检测病人的例数少与对照组比较差异无显著性。本研究选择130例GD并发白细胞减少的病人进行HLADRB1*08032和HLADRB1*1501等位基因频率检测，结果显示HLADRB1*08032和HLADRB1*1501等位基因频率均较正常对照和单纯白细胞减少症病人明显增加。对GD并发白细胞减少病人亚组进一步分析结果显示，ATDL组HLADRB1 *08032和HLADRB1*1501等位基因频率明显高于NATDL组。结果提示GD病人并发白细胞减少与HLADRB1 *08032和HLADRB1*1501等位基因存在关联，两者可能是GD病人应用ATD引起白细胞减少的易感基因。GESSL 等[7]对GD病人以及应用他巴唑治疗的病人进行HLADR检测，认为他巴唑治疗引起白细胞减少与HLADR的基因多态性相关。国内学者李梅等[8]进行了GD并发白细胞减少与HLADRB1基因多态性的关联分析表明，白细胞减少的GD病人HLADRB1*08和DRB1*15的频率较对照组和白细胞正常的GD病人明显增加，提示GD并发白细胞减少和ATD引起的GD病人白细胞减少之间有共同的免疫遗传学基础。

参考文献

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　　[5]KULA D， BEDNARCZUK T， JURECKALUBIENIECKA B， et al. Interaction of HLADRB1 alleles with CTLA4 in the predisposition to Graves disease: the impact of DRB1*07[J]. Thyroid， 2006，16(5):447453.

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　　[8]李梅，卫红艳，邱明才. Graves病白细胞减少易感性与HLADRB1基因多态性的关联[J]. 中华内分泌代谢杂志， 2001，17:202220.