【摘要】 目的 研究高尿酸血症状态下Wistar大鼠肾小管上皮细胞有机阴离子转运体3（OAT3）表达水平的变化。方法 20只雄性Wistar大鼠随机分为对照组和高尿酸血症组，高尿酸血症组饲以高酵母饲料并给予腺嘌呤100 mg/（kg·d）灌胃，定期监测大鼠血尿酸、肌酐、尿素氮水平，应用免疫组织化学技术检测大鼠肾脏近端小管上皮细胞OAT3的表达水平。结果 实验第14天，高尿酸血症组大鼠血尿酸水平显著高于对照组（t′=-15.00，P&<0.01）；高尿酸血症组OAT3的吸光度值较对照组明显降低（t=3.299，P&<0.01），灰度值较对照组明显升高（t=-3.337，P&<0.01）。结论 高尿酸血症大鼠肾小管上皮细胞中OAT3 蛋白表达水平显著降低，OAT3可作为研发治疗高尿酸血症药物作用靶点。
【关键词】 高尿酸血症 尿酸 有机阴离子转运子 免疫组织化学
［ABSTRACT］ Objective To observe the expression of organic anion transporter 3 (OAT3) in renal epithelial cells of Wistar rats with hyperuricemia. Methods Twenty male Wister rats were evenly pided into control group and hyperuricemia group in random. The hyperuricemia group was administrated with adenine 100 mg/ (kg·d) by gavage and richyeast forage. Blood UA， CR， BUN were detected regularly. The expression of OAT3 was detected by immunohistochemistry. Results On day 14， blood uric acid level of rats in hyperuricemia group was higher than that of the controls (P&<0.01). OAT3 expression was significantly decreased compared with the controls. Conclusion Low OAT3 expression is observed in hyperuricemic rat， which can be used as a target to research and explore a new medicine for hyperuricemia.
［KEY WORDS］ Hyperuricemia; Uric acid; Organic anion transporters; Immunohistochemistry
近年来高尿酸血症的患病率逐年上升，且随年龄增加而升高，已成为危害人类健康的公共卫生问题[1]。业已证实，约90%以上原发性高尿酸血症是因肾近端小管对尿酸的重吸收增加和（或）分泌减少所致。有机阴离子转运体3（OAT3）参与了肾近端小管对尿酸盐的转运[2～4]，其表达及功能缺陷可能为原发性高尿酸血症重要的发病机制之一。本实验选用雄性Wistar大鼠制备高尿酸血症模型，观察模型大鼠肾脏近端小管上皮细胞OAT3 蛋白的表达水平，以期明确OAT3在高尿酸血症状态下的变化，为研发治疗高尿酸血症药物提供新的作用靶点。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
8周龄雄性Wistar大鼠共20只，体质量（250±10）g，由青岛实验动物基地提供， SPF级实验动物房饲养。
1.1.2 仪器
Sysmex CHEMIX180型全自动生化分析仪（日本）；Simple PCI图像分析仪（Comp ix，美国）。
1.1.3 药品和试剂
UA、CRE、BUN检测试剂盒购自青岛益信公司；一抗为兔抗大鼠OAT3多克隆抗体，由北京博奥森公司制备，按1∶50配成工作液；二抗（PV6001）及 DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司，二抗为羊抗兔IgG，为工作液。其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 高酵母饲料的制备
酵母干粉均匀拌入粉碎的大鼠颗粒饲料中重新压粒成型，控制其在饲料中的质量分数为0.10。
1.2.2 动物模型的建立及分组
根据奚九一等[5]的造模方法，动物购入后，让其适应环境1周，自由饮水进食。然后将动物随机分为对照组和高尿酸血症组（实验组），每组10只。实验组饲以高酵母饲料，并给予腺嘌呤100 mg/(kg·d）灌胃，以制备高尿酸血症模型。对照组饲以普通大鼠颗粒饲料，并给予同体积的蒸馏水灌胃。两组动物自由饮水。
1.2.3 生化指标的监测
定期内眦静脉采血，分离血清后，在全自动生化分析仪上测定尿酸（UA）、肌酐（CR）和尿素氮(BUN)，监测大鼠高尿酸血症模型的建立情况及造模对大鼠肾功能的损害情况。
1.2.4 动物处死及标本处理
待血尿酸出现显著差异时处死大鼠，术前禁食14 h， 体积分数0.10的水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，开腹后分离肾脏，切除肾组织用40 g/L甲醛固定，石蜡包埋， 全部标本均1 μm厚连续切片，分别进行苏木精伊红染色和免疫组织化学染色。
1.2.5 免疫组化检测
石蜡切片脱蜡至水，体积分数0.03的h3O2室温孵育10 min，以清除内源性过氧化物酶的活性；抗原微波热修复；体积分数0.10的正常山羊血清封闭非特异性位点；倾去血清，滴加一抗工作液， 37 ℃孵育3 h；滴加二抗工作液，37 ℃孵育30 min；DAB染色；苏木精复染细胞核；封片。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.2.6 图像分析和统计学处理
对肾小管上皮细胞基底膜上OAT3免疫组化着色强度， 用Simple PCI软件测定其阳性信号灰度值及吸光度值。所得数据用SPSS 11.5 统计软件处理，各指标以±s表示，组间数据比较采用t检验。
2 结 果
2.1 两组UA、CR及BUN水平比较
造模后第14天，高尿酸血症组UA、CR、BUN水平与对照组相比均升高，差异均有显著性（t′=-15.00、-9.13、-17.59，P&<0.01)。见表1。表1 两组实验后UA、CR及BUN水平的比较（略）
2.2 大鼠肾脏组织切片苏木精伊红染色光镜观察
对照组大鼠肾脏切片， 光镜下肾小球囊腔内未见异常物质，肾曲小管、集合管亦未见异常病变，间质有轻度瘀血；高尿酸血症组大鼠肾脏切片，光镜下肾小球囊内有红细胞，伴红染物质，肾小管浊肿，肾小管及间质部位有较多的尿酸盐结晶沉积，间质有出血及大量炎性细胞浸润，尿酸盐结晶呈针状、双折光放射形排列。
2.3 肾近端小管上皮细胞OAT3表达水平
免疫组织化学染色结果显示，对照组及高尿酸血症组大鼠肾脏近端小管上皮细胞均有OAT3的表达，但高尿酸血症组大鼠OAT3的表达较对照组显著减少。Simple PCI软件分析结果显示，高尿酸血症组OAT3的吸光度值（0.202 2±0.014 3）较对照组(0.217 7±0.015 8)明显降低（t=3.299，P&<0.01）；高尿酸血症组OAT3的灰度值（160.18±5.23）则较对照组(154.56±5.53)明显增高（t=-3.337，P&<0.01）。
高尿酸血症和痛风是一种嘌呤代谢紊乱性疾病，受遗传和环境因素的影响，目前其发病机制仍不确切。约90%原发性高尿酸血症是因尿酸排泄减少所致，每日排出体外的尿酸2/3通过肾脏排泄，1/3通过肠道排泄。肾近端小管对尿酸的重吸收增加和（或）分泌减少是尿酸排泄减少的主要原因，但导致肾近端小管尿酸排泄减少的分子机制目前仍不确切。目前研究表明， 肾近端小管上皮细胞有尿酸分泌和重吸收的转运体，参与肾脏对尿酸的排泄。其中，OAT3在肾脏主要位于肾小管上皮细胞基底膜，它是一个有机阴离子二羧酸盐转运子，其底物亲和性很广，包括雌激素硫酸盐（ES）、对氨基马尿酸(PAH)、非类固醇类消炎药、利尿剂、磺溴酞、胆盐、青霉素、西米替丁以及抗高血压药溴化四乙胺，同时它还参与肾小管管周细胞对尿酸盐的摄取，从而有利于尿酸盐的分泌[3，4]。
本实验选用雄性Wistar大鼠饲以高酵母饲料加腺嘌呤灌胃，制备高尿酸血症模型，观察高尿酸血症状态下大鼠肾脏近端小管上皮细胞OAT3 蛋白表达水平的变化。实验第14天，高尿酸血症组血尿酸水平显著高于对照组（P&<0.01），提示高尿酸血症模型制备成功。此时，高尿酸血症组血肌酐、尿素氮水平亦显著高于对照组（P&<0.01），肾脏切片光镜下可见肾小管浊肿，肾小管及间质部位有较多的尿酸盐结晶沉积，间质有出血及大量炎性细胞浸润，所有这些病理特征与临床上高尿酸血症所致痛风性肾病较为相似。综上所述，Wistar大鼠造模后出现了高尿酸血症肾病。免疫组化研究显示，高尿酸血症组OAT3的吸光度值较对照组明显降低（P&<0.01），灰度值较对照组明显升高（P&<0.01），表明高尿酸血症组大鼠OAT3 蛋白表达水平显著降低。OAT3表达水平的降低可使肾脏对尿酸盐的分泌减少，从而进一步导致血尿酸水平的升高。由此可见，高尿酸血症肾病大鼠中OAT3 蛋白表达水平显著降低，以OAT3为作用靶点而上调其表达的药物，可以增加肾脏对尿酸盐的排泄而降低血尿酸水平，为研发治疗高尿酸血症的新药提供了理论依据。
此外，OAT3在肾脏对尿酸盐及一些药物的排泄中占有重要地位，在高尿酸血症病人中，OAT3的表达及活性降低，提示高尿酸血症并发其他疾病的临床治疗中，应注意一些有机阴离子药物的用法及用量调整，以防药物排泄减少导致蓄积。高尿酸血症及痛风发病机制复杂，为多基因遗传病，有多种尿酸盐转运体参与肾近端小管上皮细胞对尿酸的重吸收和分泌[6]，对其发病机制及治疗的研究应综合多种相关基因及其表达活性进行进一步研究。
【
参考文献
】[1]ARROMDEE E， MICHET C J， CROWSON C S， et al. Epidemiology of gout: is the incidence rising[J]. J Rheumatol， 2002，29:24032406.
[2]KUSUHARA H， SEKINE T， UTSUNOMIYATATE N， et al. Molecular Clonin and characterization of a new multispecific organic anion transporter from rat brain[J]. J Biol Chem， 1999，274(19):1367513680.
[3]BAKHIYA A， BAHN A， BURCKHARDT G， et al. Human organic anion transporter 3(hOAT3) can operate as an exchanger and mediate secretory urate flux[J]. Cell Physiol Biochem， 2003，13(5):249256.
[4]CHA S H， SEKINE T， FUKUSHIMA J I， et al. Identification and characterization of human organic anion transporter 3 expressing predominantly in the kidney[J]. Mol Pharmacol， 2001，59:12771286.
[5]奚九一，赵兆琳，鲁培基，等. 高尿酸血症肾病的实验动物模型研究[J]. 上海中医药杂志， 2001，10：1214.
[6]王颜刚，闫胜利，苗志敏. 高尿酸血症及痛风中西医结合研究进展[J]. 青岛大学医学院学报， 2006，42(1):9394.
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