作者：厉建元 张亚卓 姚维成 桂松柏 孙梅珍
【摘要】 目的 制作短暂性大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型，比较颈总动脉进线法和颈外动脉进线法(改良LONGA法)优劣。方法 颈总动脉进线法和改良LONGA法栓塞大鼠大脑中动脉，栓塞2 h后再灌注24 h，以LONGA法标准对模型评分，并对梗死体积进行测定， 7 d时流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果 改良LONGA法和颈总动脉进线法神经行为学评分分别为2.30±0.82和1.00±0.63，两种方法比较差异有显著性（t=6.886，P&<0.05）；两法脑梗死体积相比差异有显著性(t=3.96～4.45，P&<0.05)；两法细胞凋亡率比较差异有显著性（F=348.46，q=22.89，P&<0.05）。结论 与颈总动脉进线法相比，改良LONGA法大鼠神经行为学评分高、脑梗死体积大、凋亡细胞数多，模型稳定性好。
【关键词】 脑中动脉；再灌注损伤；细胞凋亡；大鼠
［ABSTRACT］ Objective To make a transient middle cerebral artery occlusion model in rats， and to compare the methods of occlusion of common carotid artery and LONGA’s technique. Methods The cerebral artery occlusion was obtained via blockage of either common carotid artery (CCA) or external carotid artery (modified LONGA’s group). After two hours of artery occlusion and 24 hours of reperfusion， the rats were evaluated by LONGA’s score standard. The volume of cerebral infarction was estimated by TTC staining. The number of apoptotic cells was detected by flow cytometry after seven days of occlusion. Results The neurological behavior scorings in modified LONGA’s group and CCA group were 2.30±0.82 and 1.00±0.63， respectively (t=6.886，P&<0.05). The infarction volume between the two groups was significantly different (t=3.96-4.45，P&<0.05). The number of apoptotic cells was significantly different between the two groups (F=348.46，q=22.89，P&<0.05). Conclusion Compared with the CCA occlusion group， the neurological behavior scoring of modified LONGA’s group was higher， the infarction volume was larger， the number of apoptotic cells was greater， and the stability was better.
［KEY WORDS］ Middle cerebral artery; Reperfusion injury; Apoptosis; TTC staining; Rats
大脑中动脉栓塞再灌注模型是局灶性脑缺血的标准模型。线栓法制作该模型，具有不开颅、效果肯定且可准确控制缺血及再灌注时间，便于分析神经元对缺血敏感性、耐受性及研究再灌注损害和治疗时间窗选择的优点，受广泛关注［1~5］。现将我们制作模型体会报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物
清洁级3月龄Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠102只，体质量260～300 g，购于北京市维通利华公司。栓塞再灌注模型分为：对照组（6只）、假手术组（6只）、颈总动脉（CCA）进线组（30只）和颈外动脉(ECA)进线组（30只），后两组按照处死时间分5个亚组，即1、3、5、7、14 d共5个亚组，每亚组6只大鼠。凋亡大鼠分组：分为对照组（6只）、假手术组（12只）、CCA进线组（6只）和ECA进线组（6只）。
1.2 实验试剂
10 g/L的水合氯醛（北京市神经外科研究所实验室），TTC染色剂（Sigma公司），40 g/L的甲醛（北京市化学试剂厂），凋亡试剂盒（Sigma公司）等。
1.3 实验器材
常规手术器械及显微手术器械各一套，手术显微镜，双极电凝等。
1.4 实验方法
1.4.1 线栓制作 选用日本进口鱼线［1］。将头端烧成一光滑圆球，直径在0.36 mm左右，千分尺筛选。圆球制成后在距头端5、16～18和20～22 mm处进行标记，浸泡于体积分数0.75的乙醇中备用。
1.4.2 处理方法 SD大鼠称质量后以10 g/L水合氯醛按4 mg/100 g体质量腹腔麻醉，暴露颈部，备皮，乙醇消毒。然后，分别按照CCA进线法和ECA进线法［3，4］建立模型，栓塞2 h后再灌注24 h，成功后放回笼中卫生饲养。对照组不做任何处理，假手术组按照实验组步骤处理，但是不插入线栓。每天观察动物情况。
1.4.3 神经功能缺失评分及TTC染色 按LONGA等［5］及文献［6］的标准于术后24 h行5分制评分。按照再灌注后不同时间，将大鼠断头取脑去除小脑等组织后放于生理盐水中，置于-20 ℃冰箱10 min，用特制刀片（共5片，相邻刀片间隔2 mm）沿冠状面切成2 mm厚的脑片，浸入37 ℃的20 g/L TTC-磷酸盐缓冲液中，37 ℃水浴15～30 min，数码相机照相。梗死体积由以下公式计算：梗死体积=（总体积-对侧未梗塞体积-梗塞侧未梗塞体积）/对侧未梗塞体积×100%。
1.4.4 苏木精-伊红（HE）染色 按照实验设计时间取对照组、假手术组及实验组大鼠右侧大脑行常规HE染色，中性树胶封片后置于显微镜下观察，数码相机拍照。
1.4.5 凋亡实验 取脑前步骤相同，待生理盐水灌注流出液澄清时开颅取脑。取部分脑组织用小平皿研磨，研磨时加入含体积分数0.03胎牛血清的PBS1 mL，然后将其移入10 mL离心管，向离心管中加入2.5 g/L的EDTA+50 g/L 的胰酶3 mL，37.5～37.8 ℃消化30 min，期间振荡2～3次； 取上述消化后脑组织， 用120～150目滤网过滤，加入冰PBS至10 mL，1 000 r/min离心5 min，弃上清。再次PBS清洗，1 000 r/min离心5 min；用1×Binding Buffer缓冲液制成1×109/L的细胞悬液；按照说明书设置对照组、单染组及实验组，并按说明加入Annexin Ⅴ与核酸染料（2008.2.29 Cat.No.556547，Lot 65061）。具体如下：设置4管，在Falcon试管中加入100 μL上述细胞悬液。然后，空白管不加任何试剂；Annexin Ⅴ单染管加入5 μL Annexin Ⅴ；核酸染料加入15 μL PI；双染管先加入5 μL Annexin Ⅴ，再加入15 μL PI。轻轻混匀，室温（20～25 ℃）避光处置20 min；各试管中分别加入1×Binding Buffer缓冲液至400 mL，过滤，上流式细胞仪测定细胞凋亡情况。
2 结 果
2.1 模型成功率比较
本文102只大鼠，据行为学评分，评分为0~4分和在此之前死亡动物均认为模型失败，从各组中剔除。CCA进线组大鼠神经症状学评分为1.00±0.63，而ECA进线组为2.30±0.82，两种方法比较差异有显著性（t=6.886，P&<0.05）。CCA、ECA进线造模成功率分别为72.5%、88.2%，两组比较差异有显著性（χ2 =3.981，P&<0.05）。
2.2 HE染色检查
大鼠栓塞再灌注24 h后断头取脑，行HE染色。染色结果：对照组及假手术组可见整个鼠脑神经元形态结构正常，核染色正常，无胞浆空泡形成等表现，而实验组可见基底节外侧区、顶叶、颞叶皮质(部分累及)神经元出现缺血性损害，表现为胞浆空泡形成，核固缩均质化，核周体消失等，但有一定数量基本正常神经元存在。
2.3 TTC染色及脑梗死体积测定
TTC染色见假手术组及对照组脑组织红染(着红色区域为未梗塞区，未着色区域为梗塞区)；CCA进线组和ECA进线组都有未着色区，在两组脑组织冠状切面上，TTC染色有局限的不着色区域，与周围和对侧非缺血区红染脑组织界限分明，缺血区主要位于视交叉后2～4 mm。CCA进线组梗塞体积约为24.4％，ECA进线组为35.3％。CCA进线组实验1、3、5、7、14 d组梗塞体积分别为（22.6±4.6）%、（24.4±4.8）%、（25.6±4.5）%、（25.5±4.4）%、（23.4±4.5）%，ECA进线组分别为（32.4±3.2）%、(35.3±3.6)%、(34.9±3.4)%、(34.6±3.5)%、(33.4±3.5)%。两法脑梗塞体积比较差异有显著性（t=3.96～4.45，P&<0.05）。
2.4 两种方法凋亡率比较
对照组凋亡率为0.95±0.23，假手术组凋亡率为1.01±0.22，CCA进线组凋亡率为15.39±2.34，ECA进线组凋亡率为35.23±3.54。对照组和假手术组凋亡率比较差异无显著性（F=348.46，q=0.07，P&>0.05）。对照组和CCA进线组凋亡率比较差异有显著性（q=16.63，P&<0.05）; 对照组和ECA进线组凋亡率比较差异有显著性（q=39.46，P&<0.05）； CCA进线组和ECA进线组凋亡率比较差异有显著性（q=22.89，P&<0.05）。
缺血性脑血管病动物模型是研究缺血性脑损伤和脑保护的重要工具。大鼠局灶性脑缺血动物模型除线栓法外，常用的有经颞下或眶入路电凝或结扎MCA，光化学诱导MCA血栓形成等方法［5，7］。前者需要开颅，不可避免地引起脑脊液外流且易损伤脑组织；后者在血栓形成时易引起明显微血管损伤，造成终末动脉闭塞，异于人类血管栓塞的病理改变。此类模型不能再灌注，不适合模拟人类脑梗死或溶栓药物治疗后血管再通方面的研究。因此，线栓法建立局灶性脑栓塞再灌注模型是目前常用的方法。线栓法操作方便、损伤小、成本低、重复性及稳定性好，较好地模仿了人类脑梗死发病的病理过程［8］。
神经病学评分是评价局部脑缺血及缺血性脑损害最重要的终末指标之一。TTC染色是评价脑梗死体积最重要的客观指标之一，有助于脑梗死体积的测定［9］。凋亡率是评价细胞死亡的客观指标之一。我们在实验中观察到评分为 0分者，线栓法往往是插入深度不够，TTC染色梗死范围较小，甚至可能为阴性结果，凋亡率与对照组相比亦无显著性差异。1～3分者TTC染色梗死范围较理想。4分往往见于麻醉过量，或蛛网膜下隙出血者［10］。
本实验通过ECA进线法和CCA进线法成功制作了脑缺血再灌注模型。ECA进线法制作模型神经病学评分高，但CCA进线法制作模型其评分较低，考虑与模型成功率低和再灌注效果不理想有关。模型成功率低可能与线栓插入深度不够有关；再灌注效果不理想，可能与阻断CCA，仅靠大脑前动脉和颈外动脉血流难以达到充分再灌注有关。研究结果显示，缺血侧大脑表面呈不同程度的饱满、苍白等脑水肿征象，并可见新生血管形成［11］。从HE染色结果观察，两种方法都能造成大鼠大脑神经元出现缺血性损害，胞浆空泡形成，核固缩均质化，核周体消失等病理表现，与正常大鼠大脑神经元具有较大区别［12］。
从TTC染色结果可以看出，ECA进线法较CCA进线法梗死体积大，且两法的脑梗死体积都有随时间演变的病理生理趋势。两法梗死体积均于3～5 d左右时到达最大，这与脑组织缺血再灌注后脑水肿加重，导致供血供氧减少，进一步加重了脑组织损伤有关。而1～2周后，随脑水肿的消退和自身的修复，脑梗死体积相应减少，这可从大鼠的活动、模型评分及TTC染色得到验证，从而较好地模拟了人类发病的病理生理过程，对下一步运用各种手段如加压氧、相关激素及干细胞移植等进行实验性治疗奠定了基础。
两法凋亡率的测定结果表明，ECA进线法所造成的模型脑神经元凋亡率较CCA进线法高，说明ECA进线法建模造成的脑神经元凋亡的数目更多，脑损伤较重，脑缺血再灌注更完全，表明ECA进线法造模优于CCA进线法。
本实验结果显示，ECA进线法大鼠神经行为学评分高、脑梗死体积大、凋亡细胞数多，模型稳定性好，说明该法建立脑缺血再灌注模型是目前局灶性脑缺血损伤和治疗研究较为理想的动物模型。
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