关于CX3CR1基因多态性与颈动脉内中膜增厚的关系

【摘要】 　　目的 探讨Fractalkine(FKN)受体CX3CR1 基因多态性V249I和T280M与颈动脉内中膜增厚(IMT)的相关性。方法 选取117例颈动脉IMT病人和93例无增厚对照者，通过聚合酶联反应限制性内切酶片段长度多态性(PCRRFLP)确定基因型。结果 T280M和TM与TT的OR值为1.896，与颈动脉IMT有关(95％CI:1.015～3.542，P=0.043)，而V249I和VI与VV之间差异无显著意义(95％CI:0.531～1.600，P=0.772)。多变量Logistic回归分析显示，T280M是颈动脉IMT的独立危险因素(95％CI:1.247～8.297，P=0.016)。结论 CX3CR1 T280M是颈动脉IMT的一个独立危险因素，而V249I在颈动脉粥样硬化过程中不起主要作用。
【关键词】 CX3CR1 颈动脉 动脉硬化 基因型 基因频率
　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the association between Fractalkine(FKN) receptor CX3CR1 Polymorphisms (V249I and T280M) and carotid artery intimamedia thickness (IMT). Methods This study aws done in 117 patients with carotid artery IMT and 93 subjects without carotid artery IMT (controls). Polymorphic genotypes were determined by PCRRFLP.Results The OR of T280M allele (MM and TM vs TT) was 1.896， which was associated with carotid artery IMT (95％CI：1.015-3.542，P=0.043). No significant differences were observed in 1 249 allele (95％CI：0.531-1.600，P=0.772). Multiple Logistic regression analysis revealed that the T280M allele was an independent risk factor for carotid artery IMT (95％CI:1.247-8.297，P=0.016). Conclusion CX3CR1 T280M polymorphism is an independent risk factor for carotid artery IMT，and V249I does not play a major role on the progression of carotid atherosclerosis.
　　
　　［KEY WORDS］ CX3CR1; Carotid artery; Atherosclerosis; Genotype; Gene frequency
　　
　　动脉粥样硬化受多种因素的影响，包括高血压、肥胖、糖尿病以及进展性血管损伤引起的炎性反应。动脉粥样硬化及血管内膜变化是引起脑供血障碍的重要原因[1]。血管壁炎性反应的主要特征是白细胞与血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞的相互作用，分子水平上表现为细胞因子、黏附分子及趋化因子等之间的相互作用。Fractalkine(FKN)是近年来发现的一个新的独特的趋化因子，具有可溶型和膜结合型两种存在形式。可溶型FKN有白细胞趋化的活性，而CX3CR1是FKN高选择的趋化因子受体，FKN直接捕获并黏附表达有CX3CR1的白细胞，因而提供了白细胞激活的一种新途径。文献报道，CX3CR1有2个共同的多态现象，即V249I和T280M，是完全连锁不平衡的[2]。在动物实验及人类研究中，人们均发现FKN在动脉粥样硬化病变处的表达增多。本实验拟研究CX3CR1 基因多态性和经彩色多普勒超声诊断颈动脉内中膜增厚（IMT）病人之间的关系，以分析CX3CR1 基因多态性对颈动脉IMT的发病是否有影响。
　　1 资料和方法
　　1.1 一般资料
　　
　　2005年6月～2007年4月，选择在我院神经内科病房及门诊经颈部彩色超声多普勒检查证实为IMT（0.9 mm≤IMT≤1.3 mm）病人117例，其中脑梗死73例，短暂性脑缺血发作 44例，诊断均符合全国第四届脑血管病会议制定的标准[3]，并于发病后24～48 h 内经头颅CT 和(或)MRI 检查证实。本组男70例，女47例，年龄45～83岁，平均（63.75±8.77）岁。无颈动脉IMT对照组93例，经影像学检查证实无梗死灶改变，其中男64例，女29例，年龄39～80岁，平均（61.89±9.91）岁。所有病人均行常规实验室检查。高血压的诊断根据美国JNC7及2003年ESH /ESC欧洲高血压指南标准，收缩压/舒张压≥19/12 kPa，排除继发性高血压；高脂血症的诊断根据中华医学会心血管病学分会1997年制订的《血脂异常防治建议》的诊断标准；糖尿病诊断依据WHO 2000年诊断标准，排除1型糖尿病及继发糖尿病。WHO 1984年关于吸烟调查方法标准:每天吸烟1支以上，时间&>1年为吸烟者。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 基因组DNA 提取 所有受试者均采外周血2 mL，用Promaga试剂提取基因组DNA作为PCR模板。
　　1.2.2 PCR反应 根据GenBank中的基因序列，用Premier Primer 5软件设计，上游引物为5′CCTGCAAGAACCACAAGAAAGC3′，下游引物为5′TGCTCAGAACACTTCCATGCC 3′， 由上海生工公司合成。PCR反应体系：反应总体积25 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，Premix Taq 12.5 μL，去离子水9.5 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性1 min，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后延伸10 min。 15 g/L琼脂糖凝胶电泳，扩增片段长度为360 bp(图1)。
　　1.2.3 限制性内切酶片段长度多态性分析 分别将PCR产物进行酶切电泳分析。Acl Ⅰ酶（NEB）酶切，总体积为20 μL，PCR产物 5μL，10×缓冲液 2 μL，Acl Ⅰ 0.5 μL，100×BSA 0.2 μL，去离子水12.3 μL，37 ℃过夜。HpyCH4 Ⅲ酶（NEB）酶切，总体积为20 μL，PCR产物5 μL，10×缓冲液2 μL，HpyCH4 Ⅲ 0.5 μL，去离子水12.5 μL，37 ℃过夜。15 g/L琼脂糖凝胶电泳。Acl Ⅰ酶酶切：当开放序列的745位为G的纯合子时，将限制性酶切为2个片段，即275 bp和 85 bp，电泳图上应表现为两条带；当开放序列的 745位为A的纯合子时，将不被酶切，电泳图上应表现为一条带；当开放序列的745位为A和G的杂合子时，电泳图上应表现为3条带（图2）。HpyCH4 Ⅲ酶酶切：当开放序列的839位为C的纯合子时，将限制性酶切为 2个片段，分别为182 bp和178 bp，电泳图上应表现为两条带；当开放序列的839位为T的纯合子时，将不被酶切，电泳图上应表现为一条带；当开放序列的839位为C和T的杂合子时，电泳图上表现为两条带，理论上应表现为3条带，但182 bp和178 bp这两个片段仅相差4 bp，电泳时重合在一起，表现为一条带（图3）。
　　1.3 统计学处理
　　
　　采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，数据间比较采用t检验、χ2检验，相关性采用Logistic多变量回归分析。
　　2 结果
　　2.1 两组临床资料特点
　　
　　颈动脉IMT组和对照组年龄比较差异无显著性（t=1.46，P&>0.05）；两组性别比例比较差异无显著性（P=0.204）。颈动脉IMT组高血压68例，高脂血症55例，糖尿病41例，吸烟者43例；对照组高血压37例，高脂血症28例，糖尿病21例，吸烟者20例，两组高血压、高血脂、糖尿病、吸烟比例比较差异均有统计学意义（P=0.008～0.049）。
　　2.2 两组CX3CR1 V249I和T280M基因多态性的基因型比较
　　
　　颈动脉IMT组和对照组V249I基因型频率比较差异无显著意义（χ2=0.084，OR=0.922，P&>0.05），I等位基因频率比较差异无显著意义（χ2=0.066，OR=1.059，P&<0.05）。见表1。两组的T280M基因型频率比较差异有统计学意义（χ2=4.084，OR=1.896，P&<0.05），M等位基因频率IMT组较对照组高，差异有显著意义（χ2=4.897，OR=1.829，P&<0.05）。见表2。两组各等位基因频率符合HardyWeinberg的遗传平衡定律（P&>0.05），说明所研究人群有群体代表性。
　　2.3 与颈动脉IMT有关的可能危险因素
　　
　　以颈动脉IMT为因变量，吸烟、高血压、高脂血症、糖尿病、M280等位基因为自变量进行多变量Logistic回归分析，结果显示，吸烟、高血压、高脂血症、M280等位基因进入方程并有统计学意义。见表4。M280等位基因是颈动脉IMT的一个独立危险因素（OR=2.295，P=0.019，95%CI为1.148～4.588）。见表3。
　　表1 颈动脉IMT组和对照组CX3CR1基因V249I多态性的基因频率（略）
　　表2 颈动脉IMT组和对照组CX3CR1基因T280M多态性的基因频率（略）
　　表3 多变量Logistic回归分析结果（略）
　　图1 PCR扩增产物电泳结果（略）
　　
　　M为Maker， ①、②、③均为PCR产物
　　图2 Acl Ⅰ酶酶切结果（略）
　　
　　M为Maker，①为VV型，②为II型，③为VI型
　　图3 HpyCH4 Ⅲ酶酶切结果（略）
　　
　　M为Maker，①为MM型，②为TM型，③为TT型
　　3 讨论
　　
　　FKN属于CX3C亚家族，与其他趋化因子不同的是，它有两种存在形式。可溶型FKN为化学诱导物，而膜结合型则为黏附分子。膜结合型FKN趋化因子部分位于黏蛋白蒂样结构突出的表面，有利于细胞的黏附。FKN表达在内皮细胞、上皮细胞、树状突细胞及神经元，并可被前炎性细胞如IL1和TNFα诱导。FKN受体CX3CR1在大量白细胞包括单核细胞、T细胞亚群和NK细胞的表面表达，它可介导白细胞的迁移和黏附。因此，在静态或生理流速下表达CX3CR1的细胞无需与蛋白多糖和其他黏附分子相结合即可有效地黏附FKN或表达FKN的细胞。CX3CR1基因有两种常见的多态性：V249I和T280M，它们分别位于CX3CR1第6和第7跨膜区，是由于异亮氨酸和蛋氨酸在密码子249和280 处分别替代了缬氨酸和苏氨酸，这种等位基因分布的不平衡可能与动脉粥样硬化的发生有关。FKN在损伤的内皮细胞表达较高，外周血单核细胞上的CX3CR1增强CX3CR1/FKN的相互作用，导致单核细胞在损伤的动脉壁黏附和迁移。动物实验结果显示，CX3CR1敲除的单核细胞与FKN结合力和趋化活性均下降，CX3CR1和apoE都敲除的小鼠与仅apoE敲除的小鼠相比，巨噬细胞在动脉壁上的浸润显著降低。因此，CX3CR1/FKN路径在富含巨噬细胞的动脉粥样硬化病变中起直接和主要作用[4]。
　　
　　颈动脉血管壁IMT是粥样硬化的早期指征，而斑块形成是其明显特征。血管内膜增殖是血管损伤后修复的普遍反应[5]，在未造成动脉管腔狭窄之前，病变主要发生在内膜层，因此粥样斑块形成与动脉壁内膜增厚有密切关系。当斑块形成并突入管腔时，由于其富含脂质，动脉壁顺应性下降，应力增大，同时受高速血流冲击，斑块可发生破裂，暴露的脂质和胶原可激活血小板，由此启动体内凝血系统而形成血栓，或发生出血、溃疡、斑块脱落等而造成缺血性脑血管病[6]。

　　本研究对117例颈动脉IMT病人和93例对照者进行基因分析，结果显示，颈动脉IMT组和对照组I等位基因频率比较差异无显著性，而M等位基因频率比较差异有显著意义。而GHILARDI等[7]和NORATA等[8]的研究结果则显示，病例组和对照组I和V等位基因频率比较差异均有显著意义。其原因可能与种族差异或样本例数有关。同时NORATA指出，携带VIMM和IIMM基因型的个体内膜增厚程度明显降低，M280与减少颈动脉内膜增厚有关，而V249I在颈动脉粥样硬化进展中不起主要作用[8]。本文多因素Logistic回归分析结果显示，T280M是颈动脉IMT的独立危险因素，是除吸烟、高血压、高脂血症外，颈动脉IMT的又一独立危险因素。GHILARDI等[7]对84例颈内动脉内膜切除的病人和204例对照者进行了CX3CR1基因多态性分析，结果显示，CX3CR1 M280等位基因与颈内动脉闭塞性疾病的发生率降低显著相关，而V249I等位基因与斑块稳定性相关[7]。而心血管疾病研究显示，M280等位基因与心血管疾病危险性降低有关，V249I则无明显相关性[9]。出现上述差异可能基于下列机制：①CX3CR1 T280M变异不改变配体结合，但在很大程度上损伤了受体介导反应，包括趋化性和黏附性；②为外周CX3CR1受体非正常的表达，使表达CX3CR1受体的细胞对内皮细胞上膜结合型FKN的趋化和黏附能力均显著下降，从而减轻了内皮细胞的损伤；③携带VI基因型的病人单核细胞上FKN结合位点明显减少及血管内皮舒张功能提高使动脉粥样硬化斑块稳定。目前对其机制仍不十分明确，需更进一步深入研究。
　　
　　对于M280和V249I在动脉粥样硬化中的作用迄今仍存在争议。MCDERMOT等[10]认为，尽管CX3CR1 M280经常与CX3CR1 V249I同时存在，但前者与冠状动脉疾病发生率的下降具有更明显的相关性。对心血管和脑血管疾病同时进行研究显示，CX3CR1基因多态性有相反的作用，IM纯合子仅在无心血管病史的个体中与脑梗死的危险性增加有关，而对有心血管病史的个体，IM纯合子则有降低脑梗死危险的趋向[11]。
　　
　　MOATTI等[12]研究显示，具有CX3CR1 249杂合子基因的个体发生急性冠状动脉事件的概率明显减少，而未发现M280等位基因与急性冠状动脉事件的减少存在显著相关。也有研究指出，I或M等位基因对症状性冠心病的发生没有影响[9]。
　　
　　综上所述，CX3CR1 M280是颈动脉IMT一个独立危险因素，而V249I在颈动脉粥样硬化进展过程中不起主要作用。深入探讨FKN与CX3CR1的相互作用对预防动脉粥样硬化的发生发展及颈动脉斑块形成有一定意义，但仍需前瞻的大型研究来进一步证实。

参考文献

　　[1]刘松，盛文旭，张勇. 维奥欣对高血压并颈动脉粥样硬化病人脑血流动力学参数的影响[J]. 青岛大学医学院学报， 2005，41(2)：105106.

　　[2]FAURE S， MEYER L， COSTAGLIOLA D， et al. Rapid progression to AIDS among HIV1 inpiduals with an allelic variant of the CX3CR1 chemokine receptor[J]. Science， 2000，287:22742277.

　　[3]中华神经科学会. 各类脑血管疾病诊断要点[J]. 中华神经科杂志， 1996，29(4):379.

　　[4]COMBADIERE C， POTTEAUX S， GAO J L， et al. Decreased atherosclerotic lesion formation in CX3CR1/Apolipoprotein E double knockout mice[J]. Circulation， 2003，170(7):10091016.

　　[5]郭英华，董果雄，王国栋，等. 全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化模型内膜增殖的影响[J]. 青岛大学医学院学报， 2005，41(2)：129131.

　　[6]SZTAJZEL R. Ultrasonographic assessment of the morphological characteristics of the carotid plaque[J]. Swiss Med Wkly， 2005，135(4344):635643.

　　[7]GHILARDI G， BIONDI L M， TURRI O， et al. Internal carotid artery occlusive disease and polymorphisms of fractalkine receptor CX3CR1:a genetic risk factor[J]. Stroke， 2004，35(6):12761279.

　　[8]NORATA G D， GARLASCHELLI K， ONGARI M， et al. Effects of fractalkine receptor variants on common carotid artery intimamedia thickness[J]. Stroke， 2006，37(6):15581561.

　　[9]MCDERMOTT D H， HALCOX J P， SCHENKE W H， et al. Association between polymorphismin the chemokine receptor CX3CR1 and coronary vascular endothelialdysfunction and atherosclerosis[J]. Circ Res， 2001，89(5):401407.

　　[10]MCDERMOTT D H， FONG A M， YANG Q， et al. Chemokine receptor mutant CX3CR1M280 has impaired adhesive function and correlates with protection from cardiovascular disease in humans[J]. J Clin Invest， 2003，111(8):12411250.

　　[11]LAVERGNE E， LABREUCHE J， DAOUDI M， et al. Adverse associations between CX3CR1 polymorphisms and risk of cardiovascular or cerebrovascular disease[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2005，25(4):847853.

　　[12]MOATTI D， FAURE S， FUMERON F， et al. Polymorphism in the fractalkine receptor CX3CR1 as a genetic risk factor for coronary artery disease[J]. Blood， 2001，97(7):19251928.