关于刺参黏多糖对Hela细胞增殖分化的影响

【摘要】 　　目的 了解刺参酸性黏多糖（SJAMP）对Hela细胞增殖、分化的影响及其机制。方法 体外培养Hela细胞，通过MTT法观察SJAMP对Hela细胞增殖的作用，电镜观察SJAMP作用下Hela细胞超微结构的变化，RTPCR法检测Hela细胞CyclinD1、CDK4、Cmyc的mRNA的表达。结果 SJAMP能够有效抑制Hela细胞的增殖，并且具有剂量和时间依赖关系。透射电镜观察显示，SJAMP可诱导细胞向成熟细胞分化；SJAMP可以明显降低CyclinD1、CDK4、Cmyc的mRNA表达。结论 SJAMP可能是通过抑制细胞周期因子CyclinD1和CDK4的表达而抑制细胞增殖，通过抑制癌基因Cmyc的表达来诱导Hela细胞分化。
【关键词】 刺参 葡糖氨基聚糖类 Hela细胞 细胞增殖 细胞分化
　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of Stichopus japonicus acidic mucopolysaccharide (SJAMP) on proliferation and differentiation of Hela cells and its corresponding mechanism. Methods Hela cells were cultured in vitro and treated with SJAMP. Effect of SJAMP on the cell proliferation was evaluated by MTT assay. Ultrastructural changes of Hela cells were observed by electron microscope. CyclinD1， CDK4， Cmyc mRNA expressions were determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR). Results An inhibitory effect of SJAMP was noticed in SJAMPtreated Hela cells and the inhibition was observed in doseand timedependent manner. Electron microscopy observation showed that SJAMP promoted cells differentiation. SJAMP decreased the mRNA expressions of CyclinD1， CDK4 and Cmyc genes. Conclusion SJAMP might inhibit the proliferation of Hela cells via decreasing the expressions of CyclinD1， CDK4， and induct the differentiation of Hela cells via decreasing the expressions of Cmyc gene.
　　
　　［KEY WORDS］ Stichopus; Glycosaminoglycans; Hela cells; Cell proliferation; Cell differentiation
　　
　　剌参酸性黏多糖(SJAMP)是由刺参体壁提取的一种动物酸性黏多糖[1]。经药理实验结果证明，SJAMP具有广谱抗肿瘤、抗凝血及增强机体免疫功能等活性[2，3]，特别是其抗肿瘤作用日益受到重视。王振立等[4]研究结果显示，SJAMP可明显抑制肿瘤细胞DNA的合成从而抑制肿瘤生长，而对正常细胞的DNA合成有明显促进作用，这有利于正常细胞的增殖，表明SJAMP对肿瘤细胞及正常细胞具有一定的选择性作用。本实验选择人宫颈癌细胞Hela系作为研究对象，探讨了SJAMP对Hela细胞增殖、分化的作用及其可能的作用机制。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　
　　人宫颈癌细胞Hela系，青岛大学医学院微生物学实验室赠；SJAMP，中国海洋大学医药学院提取，相对分子质量122 248，纯度99.5%；DMEM培养基、胰蛋白酶，GIBCO公司产品；胎牛血清，杭州四季青公司产品；TRIzol试剂，GIBCO公司产品；反转录试剂盒，Promega公司产品；Taq DNA聚合酶，上海中科开瑞生物芯片科技股份有限公司产品；DNA Marker、Marker 2000，Takara公司产品。BNP310恒温CO2培养箱，日本TABAI ESOEC公司；PCR仪，Biometra公司；EAR 400AT酶标仪，奥地利；JEM扫描电镜，日本JEOL公司；ViDAS21图像分析系统，德国欧波同公司；天能凝胶图像分析系统，上海天能科技公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养 Hela细胞常规培养于含有体积分数0.10胎牛血清，100 kU/L青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM培养基中，置于37℃，体积分数0.05的CO2培养箱中培养。
　　1.2.2 SJAMP对Hela细胞增殖的作用观察 采用MTT法。取指数生长期细胞加消化液消化制成单细胞悬液，计数、调整细胞浓度为1×107/L，取上述细胞悬液接种于96孔板，每孔200 μL。每组做6个平行样品。37 ℃，体积分数0.05的CO2孵育过夜，使细胞贴壁生长。第2天换含不同浓度SJAMP（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L）的培养液，对照组换不含SJAMP的培养液，均置37 ℃，体积分数为0.05的CO2孵育。药物作用3 d后，加入5 g/L的MTT20 mL，37 ℃孵育4 h，去掉上清液，采用细胞内形成的蓝色结晶溶解于150 μL DMSO。酶联免疫检测仪测定570 nm波长处各孔吸光度（A）值，按公式计算SJAMP对Hela细胞的抑制率。抑制率=(对照组A值-实验组A值)／对照组A值×100%。
　　1.2.3 不同浓度SJAMP作用后Hela细胞的形态结构变化观察 用浓度为0.8、1.2和1.6 g/L 的SJAMP培养液分别在细胞培养瓶中作用于Hela细胞1、3、5 d，对照组Hela细胞正常生长1、3、5 d，在相应时间点倒掉培养液，分别使用DHanks液冲洗3次，光学显微镜下观察细胞形态的变化。再将SJAMP处理过的Hela细胞收集、常规消化离心后，经固定、脱水、包埋、固化、染色、切片等处理，在JEM1200EX透射电镜下观察。
　　1.2.4 SJAMP对Hela细胞CyclinD1、CDK4和 Cmyc的mRNA表达影响 采用RTPCR法检测。以βactin作为内参照，目的基因片段为CyclinD1、CDK4和Cmyc。引物均由Primer 5.0软件设计，上海生工生物技术服务有限公司合成。CyclinD1：上游引物为5′ATGGAACACCAGCTCCTGTGCTGC3′，下游引物为5′TCAGATGTCCACGTCCCGCACGT3′，扩增产物长度为888 bp；CDK4：上游引物为5′ATGGCTACCTCTCGATATGAGCCA3′，下游引物为5′TCACTCCGGATTACCTTCATCCTT3′，扩增产物长度为912 bp；βactin：上游引物5′TCTGTGGCATCCACGAAACT3′，下游引物5′GAAGCATTTGCGGTGGACAAT3′，扩增产物长度为375 bp。反应条件：94 ℃5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。Cmyc：上游引物5′CTACTGCGACGAGGAGGAGAACT3′；下游引物5′AGAAGCCGCTCCACATACA3′；扩增产物长度为347 bp。βaction：上游引物5′CTTAGCACCCCTGGCCAAG3′；下游引物5′GATGTTCTGGAGAGCCCCG3′；扩增产物长度为152 bp。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。电泳后的凝胶迅速采用紫外线透射仪进行观察，拍照，并输入天能凝胶成像分析系统进行分析。目的PCR产物的吸光度与内参照PCR产物吸光度的比值，即为半定量RTPCR结果。
　　1.3 统计学处理
　　
　　采用SPSS 11.5软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较应用q检验。
　　2 结果
　　2.1 SJAMP对Hela细胞增殖的作用
　　
　　与对照组比较，各浓度SJAMP组A值均降低，随着浓度的增高，A值降低愈明显，差异有显著性(F=658.20，q=3.06～45.32，P&<0.05、0.01)。随着SJAMP剂量的加大，细胞数量减少，抑制率增大，呈明显的剂量依赖关系，至8.0 g/L时细胞基本上全部被杀死A值相应减小(q=3.91～42.27，P&<0.01)。见表1。　
　　表1 不同浓度SJAMP作用下细胞A值及抑制率比较（略）
　　与对照组比较，F=658.20，*q=3.06～45.32，P&<0.05、0.01；不同浓度SJAMP组间两两比较，#q=3.91～42.27，P&<0.01
　　2.2 不同浓度SJAMP作用后Hela细胞形态结构的变化
　　
　　光镜下观察，不同浓度SJAMP作用于Hela细胞后明显抑制细胞的增殖，随着药物浓度的增加，作用时间的延长，SJAMP对Hela细胞增殖的抑制作用愈强，呈明显的剂量和时间依赖关系。未加药组Hela细胞排列密集，细胞体积较大，呈多边形，大小不一，培养液中见少许漂浮的细胞；而加SJAMP各组随药物浓度增大细胞数量减少，排列稀疏，体积瘦小，呈长梭形或圆形，伸出长的不规则突起，培养液中有许多漂浮的桑椹样细胞。
　　透射电镜下，未加药组Hela细胞体积增大，呈圆形、卵圆形或不规则形，细胞核大、不规则，核周有凹陷性切迹，有多个核仁，核浆比例大，核分裂相多见（图1a、b）；加药组Hela细胞体积缩小，呈圆形或卵圆形，核小、核形趋于规则，核膜光滑无切迹，核仁减少甚至消失，核分裂少见，核浆比例下降，核内异染色质增多，胞浆内出现发育良好的线粒体、高尔基复合体等细胞器（图1c）。
　　2.3 SJAMP 作用对Hela 细胞CyclinD1、CDK4和 Cmyc mRNA表达的影响
　　
　　在3个时间组的实验中，SJAMP可以明显降低CyclinD1、CDK4和 Cmyc在Hela 细胞中的表达，并且随着时间的延长，降低的幅度越明显。在各时间组中，随着SJAMP作用浓度的提高，CyclinD1、CDK4和 Cmyc表达降低的越明显，有一定的浓度时间依赖关系（图2～4）。
　　图1 不同浓度SJAMP作用后Hela细胞电镜下形态结构的变化（略）
　　a:未加药细胞×5 000;b:未加药细胞×2 500;c:加药细胞×4 000
　　图2 SJAMP 对CyclinD1 mRNA表达的影响（略）
　　
　　a:CyclinD1 mRNA电泳结果，①～④分别为SJAMP 0.0，0.8，1.2，1.6 g/L作用1 d；⑤～⑧分别为SJAMP 0.0，0.8，1.2，1.6 g/L作用3 d；⑨～分别为SJAMP 0.0，0.8，1.2，1.6 g/L作用5 d;b:CyclinD1 mRNA降低幅度柱形图
　　图3 SJAMP对 CDK4 mRNA表达的影响（略）
　　
　　a:CDK4 mRNA电泳结果，①～④分别为SJAMP 0.0，0.8，1.2，1.6 g/L作用1 d；⑤～⑧分别为SJAMP 0.0，0.8，1.2，1.6 g/L作用3 d，⑨～分别为SJAMP 0.0，0.8，1.2，1.6 g/L作用5 d;b:CDK4 mRNA降低幅度柱形图
　　图4 SJAMP 对Cmyc mRNA表达的影响（略）
　　
　　a:Cmyc mRNA电泳结果，①～④分别为SJAMP 0.0，0.8，1.2，1.6 g/L作用1 d；⑤～⑧分别为SJAMP 0.0，0.8，1.2，1.6 g/L作用3 d；⑨～分别为SJAMP 0.0，0.8，1.2，1.6 g/L作用5 d;b:Cmyc mRNA降低幅度柱形图
　　3 讨论
　　
　　肿瘤是严重危害人类健康的一大类疾病，人们一直致力于抗肿瘤治疗的研究，而天然海洋活性物质的抗肿瘤作用日益成为研究的新热点。SJAMP作为一种天然海洋生物抗癌化合物，能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化，从而起到抗肿瘤作用。目前，虽然有对SJAMP的研究，但多着重于动物整体及功能性研究，而体外及机制性的研究较少，其抗肿瘤作用的机制尚不十分清楚。鉴于SJAMP抗肿瘤作用的药效特点不明，本实验选用通用癌细胞株Hela细胞作为研究对象，主要研究了SJAMP对肿瘤细胞的抑制增殖、诱导分化作用，并对其可能的作用机制进行了初步探讨。

　　细胞周期失调在肿瘤的发生发展中起着关键作用，在与生长增殖有关的内源性因素即细胞周期蛋白周期蛋白依赖性激酶周期蛋白依赖性激酶抑制物系统（CyclinsCDKsCKIs系统）中，其中CDK的时相激活是细胞周期调控机制的核心，CDK主要依赖于Cyclin的细胞周期性或时相性表达、累积与分解[5，6]。CyclinD1/CDK4被认为在细胞周期G1到S的转换进程中发挥了极为重要的作用，是癌细胞增殖的关键的调控因子[7]。HORTWELL等[8]研究显示，CDK4能够与CyclinD1、增殖细胞核抗原等结合成复合物而活化，促进细胞增殖。而CyclinD1主要通过激活CDK4促进细胞越过G1/S限制点。故高表达的CyclinD1可缩短G1期时间，细胞过度增殖失控而促进肿瘤的发生。CDK4和CyclinD1作为癌细胞增殖的关键的调控因子也存在于宫颈癌中，刺激宫颈癌细胞的增殖。相关研究表明，CDK4和CyclinD1在宫颈癌中的阳性表达显著高于正常宫颈上皮，宫颈癌中CyclinD1的表达增高时，CDK4活性也增高，二者的升高程度与宫颈癌细胞的增殖程度呈正相关[9，10]。丁守怡等[11]就多糖类物质对人宫颈癌Hela细胞体外生长的影响做过一些研究，证明了多糖类有明显抑瘤作用。本实验通过光镜观察及MTT研究显示，SJAMP能够抑制Hela细胞的增殖，在其作用下Hela细胞数量明显减少，形态发生改变，并且随着作用时间的延长，作用浓度的增大，抑制作用愈加明显；本文RTPCR结果还显示，SJAMP能够降低Hela细胞中CyclinD1和CDK4的表达水平，药物浓度越大，作用时间越长，下降的幅度越明显，有一定的时间剂量依赖关系。由此我们推测，SJAMP抑制肿瘤细胞增殖可能是通过调控细胞周期调控蛋白的表达来实现的，CyclinD1和CDK4在SJAMP抑制增殖中发挥了重要的作用，其表达降低可能是SJAMP抗肿瘤分子机制之一。
　　
　　细胞无限快速增殖是恶性肿瘤细胞基本特征之一，而分化又与增殖呈拮抗状态，细胞增殖速度减慢常是细胞分化的结果。本实验研究表明，SJAMP除了能抑制肿瘤细胞增殖外，还能诱导肿瘤细胞的分化。本文电镜观察显示，SJAMP作用下Hela细胞生长减慢，趋向成熟分化，出现成熟细胞的特征，如细胞核浆比例减小，核小趋向规则形且核仁减少或消失，异染色质增多，胞质内出现线粒体、高尔基复合体等分化良好的细胞器。有研究表明，Cmyc是与细胞分化密切相关的原癌基因，其过量表达可能参与正常细胞向恶性肿瘤细胞的转化过程，在肿瘤形成过程中起着重要作用[12，13]。Cmyc 基因的不恰当表达与癌的发生有关[14]，在结肠癌、宫颈癌和白血病等人类恶性肿瘤中都有Cmyc 蛋白产物的过表达[15]。本实验RTPCR结果显示，SJAMP作用下Hela细胞中Cmyc基因mRNA水平表达下调，而且随着时间的延长和作用浓度的增大，下调的幅度增大。由此我们推测，下调肿瘤细胞中原癌基因Cmyc表达的水平可能是SJAMP 诱导肿瘤细胞分化的重要的机制之一。
　　
　　综上所述，本实验应用MTT、光镜及透射电镜观察细胞数量和形态的变化，RTPCR检测Hela细胞中CyclinD1、CDK4、Cmyc的表达水平，结果显示，SJAMP能够抑制Hela细胞增殖，诱导细胞向成熟细胞分化，其作用机制可能与下调细胞周期因子和癌基因的水平有着密切的关系。SJAMP作为一种天然海洋药物，值得进一步的研究和开发，具有广阔的应用前景。
【

参考文献

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