CD59位点短肽封条对HeLa细胞凋亡有关基因caspase3和survivin作用

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　　　　　　作者：李先平 高美华 石学香 张蓓 程颖

【摘要】 　　目的 检测CD59位点短肽封条对HeLa细胞凋亡相关基因caspase3、survivin表达水平的影响，探讨CD59位点短肽封条促肿瘤细胞凋亡的可能机制。方法 将CD59位点短肽封条作用于HeLa细胞，利用免疫组织化学方法检测短肽封条作用12 h 和24 h后HeLa细胞caspase3、survivin的表达水平。结果 caspase3表达随短肽封条剂量和作用时间的增加而增加；survivin表达随短肽封条的剂量和作用时间的增加而减少。结论 CD59位点短肽封条能下调survivin的表达并活化 caspase3，从而可能导致HeLa细胞的凋亡。
【关键词】 抗原 CD59 短肽封条 survivin caspase 3 免疫组织化学
　　［ABSTRACT］ Objective To study the effect of peptide seals on CD59 to HeLa cells， detect expression of apoptosisrelated gene survivin， caspase3 in HeLa cell and investigate the mechanism of peptide seals to CD59 in inducing apoptosis of HeLa cells.Methods The peptide seals to CD59 were put into HeLa cells. Expressions of caspase3 and survivin were detected by immunohistochemistry after interaction with peptide seals for 12 and 24 hours， respectively. Results Expression of caspase3 increased， while survivin decreased with increase of dosage of the peptide seals and prolongation of action time. Conclusion The peptide seal to CD59 can downregulate the expression of survivin， activate caspase3 and play a great role in enhancing the apoptosis of HeLa cells.
　　
　　［KEY WORDS］ Antigens， CD59; Peptide seal; Survivin; Caspase3; Immunohistochemistry
　　
　　CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚着于细胞膜表面的具有抑制补体效应功能的糖蛋白。它可以通过与C8或C9的竞争性结合而抑制攻膜复合体MAC在细胞膜的形成，是宿主细胞免受活化的补体攻击的最重要的补体调节蛋白。全球医学界始终致力于寻找特异性作用于肿瘤组织或细胞的抗瘤药物。以单克隆抗体为主要载体的“生物导弹”以其特异性高、毒性小等优点，曾被寄予很大的希望。但是由于肿瘤免疫逃逸的问题，使得单克隆抗体的临床应用受到很大限制。研究发现，CD59与肿瘤的生长失控及转移密切相关[1]。由于在很多实体瘤细胞膜表面存在或者高表达CD59 等一系列的膜补体调节蛋白，使得肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视以及靶向单克隆抗体治疗中由补体介导的溶细胞作用[2，3]，免疫逃逸是导致众多肿瘤治疗方案失败的重要原因。目前，在实体肿瘤的免疫治疗中，一个更加有效的策略是使肿瘤细胞膜上的补体调节蛋白失活或不表达。国内外学者研究证实， CD59分子中N37～H44位氨基酸与人类糖尿病血管增殖症的发生密切相关[4，5]，但与肿瘤细胞逃逸信号密切相关CD59活性位点的研究国内外鲜有报道。本课题组利用噬菌体肽库筛选技术体外合成了可阻断与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽封条[6]。本研究采用该短肽封条作用于HeLa细胞，观察其对HeLa细胞的封闭作用，并探讨其诱导HeLa细胞凋亡的可能机制。现将结果报告如下。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　
　　1 000 mg/L的CD59位点的短肽封条由本课题组设计，送北京中科亚光生物科技有限公司合成；HeLa细胞由本实验室保存；caspase3、survivin免疫组化试剂购于武汉博士德公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 CD59位点的短肽封条的设计与合成 本课题组利用噬菌体显示技术和生物信息技术从噬菌体随机12肽库中对转染人CD59的CHO细胞和转染突变人CD59的HeLa细胞进行全细胞筛选，经过5轮亲和富集筛选后，得到3条高度同源的多肽序列：HSACDLLMHPMC，HSACDLPMHPMC，HSACDLPKAPWC，运用DNA STAR 软件进行分析，3种序列与已公布的CD59的天然配体CD2（PubMed: 339HGAAENSLSPSS）都含有H×A××××××P××一级结构。而且，HGAAENSLSPSS含有10个疏水性氨基酸，与获得的含有9个疏水性氨基酸的3种序列比较接近。测序后的碱基序列转换为氨基酸序列，并将一致性的短肽序列提交PIR国际蛋白质数据库进行查询比对，进行同源性分析，未发现有同源性一致的序列。将同源性高的序列送北京中科亚光生物科技有限公司进行短肽合成。
　　1.2.2 细胞培养 在含有体积分数0.008胎牛血清、100 mg/L青霉素及链霉素的RPMI 1640 培养液中，于37 ℃体积分数0.05 CO2培养箱中培养细胞， 每48 h换液传代1次， 取生长良好的细胞进行实验。
　　1.2.3 caspase3、survivin免疫组织化学染色 采用培养的对数生长期的细胞，以每孔105个细胞接种于24孔培养板（每孔铺有一小块盖玻片），每孔加1 mL的RPMI 1640完全培养液。实验设立HeLa细胞对照组（Ⅰ组）；HeLa细胞+10 mg/L CD59位点的短肽封条作用12 h组（Ⅱ组）；HeLa细胞+10 mg/L CD59位点的短肽封条作用24 h组（Ⅲ组）；HeLa细胞加50 mg/L CD59位点的短肽封条作用12 h组（Ⅳ组）；HeLa细胞加50 mg/L CD59位点的短肽封条作用24 h组（Ⅴ组）。培养48 h后，Ⅰ组取出3张盖玻片用40 g/L的多聚甲醛固定。给予细胞换液，Ⅰ组仍然每孔加RPMI 1640的完全培养液1 mL；Ⅱ组和Ⅲ组每孔加入1 mL含有10 mg/L CD59位点短肽封条的RPMI 1640完全培养液；Ⅳ组和Ⅴ组每孔加入1 mL含有50 mg/L CD59位点短肽封条的RPMI 1640完全培养液。培养12 h，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅳ组每组各取出3张盖玻片，用40 g/L的多聚甲醛固定。其余的细胞继续培养12 h后，Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅴ组每组各取出3张盖玻片，用40 g/L的多聚甲醛固定0.5 h后，取出全部的盖玻片进行免疫组织化学染色。免疫组织化学的染色步骤按照试剂盒说明书操作。采用HPIAS 22000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统对caspase3和survivin 的表达进行定量分析，每张爬片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(400倍)，测定每个视野下阳性反应的平均吸光度。以每例5个视野的平均吸光度作为该例的测量值。
　　1.2.4 统计学分析 应用SPSS 10.0软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。
　　2 结果
　　2.1 细胞免疫组织化学染色
　　
　　caspase3、survivin阳性染色主要定位于细胞质，也可见细胞核着色。
　　2.2 各组caspase3、survivin表达的比较
　　
　　Ⅲ组、Ⅱ组与对照组比较，Ⅴ组、Ⅳ组分别与Ⅲ组、Ⅱ组比较，Ⅲ组与Ⅱ组比较，Ⅴ组与Ⅳ组比较，caspase3的表达量显著升高（t=4.26～14.07，P&<0.01）；Ⅲ组、Ⅱ组与对照组比较，Ⅴ组、Ⅳ组分别与Ⅲ组、Ⅱ组比较，Ⅲ组与Ⅱ组比较，Ⅴ组与Ⅳ组比较， survivin的表达量降低（t=3.01～10.29，P&<0.05、0.01）。见表1、2。
　　表1 各组HeLa细胞caspase3表达的平均吸光度值比较（略）
　　表2 各组HeLa细胞survivin表达的平均吸光度值比较（略）
　　3 讨论
　　
　　国内外报道，在多种实体肿瘤细胞中如肠道、卵巢、前列腺等发现有CD59分子的过表达，并发现CD59分子与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关。因此，CD59分子已逐渐成为研究肿瘤细胞逃逸自身免疫监视及肿瘤免疫导向治疗中新的靶点和热点。但作为与肿瘤逃逸信号密切相关的CD59活性位点的研究国内外未见相关报道。本课题组已经利用噬菌体显示技术和生物信息技术从噬菌体随机12肽库中对转染人CD59的CHO细胞进行全细胞筛选，经过5轮亲和富集筛选后，设计并体外合成了与人CD59分子特异结合的短肽封条[7]。
　　
　　caspase3是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶。caspase3 活化主要有两条途径：一是经细胞表面膜受体如Fas、肿瘤坏死因子1 型受体相关蛋白 (TNFR1)等活化；另一途径是在死亡刺激因子作用下，线粒体释放细胞色素C[8]。体外实验证实，caspase3活化的两条途径都可被survivin 抑制。survivin 可直接作用于caspase3 和caspase7：一方面可以与有活性的caspase3 和caspase7 特异性结合， 当caspase3 与survivin 结合后，即在细胞内失活；另一方面survivin也能阻止caspase3 和caspase7 的自发激活，从而抑制细胞的凋亡。survivin基因是近几年分离鉴定的，是目前所发现的最强的凋亡抑制基因[9]。survivin编码产生含142个氨基酸的蛋白，主要通过抑制caspase3、caspase7蛋白酶活性而抑制细胞凋亡[10，11]。其过量表达可能导致肿瘤细胞逃避细胞周期检测点，从而使肿瘤细胞逃避凋亡，实现异常增殖，导致肿瘤的形成。本研究结果显示，CD59特异位点的短肽封条作用于HeLa细胞后，随着作用时间和短肽剂量的增加，caspase3的表达量逐渐增加，survivin的表达量逐渐减少。由此证明特异性的短肽封条与HeLa细胞膜上的CD59结合后，能促进caspase3的表达，抑制survivin的表达。说明CD59特异位点短肽封条可能有促进HeLa细胞凋亡的作用。

转贴于 　　有文献报道，CD59与特异的单克隆抗体交联以后，能产生钙离子流，使胞浆内的钙离子浓度升高[12]。钙离子浓度升高以后，线粒体摄取钙离子，线粒体钙超载导致线粒体损伤， 细胞色素C 释放， 活化caspases， 诱导细胞凋亡[13]。我们的短肽封条的一级结构和CD59的天然配体CD2有部分同源序列，上述机制可能在引起细胞的凋亡过程中起一定的作用。另外，我们也观察到ACDLLM短肽存在于TNFR1中，而我们合成的短肽中也含有ACDLLM短肽序列。据MONLEON等[14]研究显示，CD59是通过肿瘤坏死因子和细胞凋亡发生密切联系。所以我们推测短肽封条和CD59特异位点结合后，其机制可能是短肽能起到类似TNFR1的作用，引起一系列的反应，从而激活caspase3引起凋亡。关于短肽封条引起凋亡的进一步机制，本课题组将在动物实验中做进一步的研究。本研究为肿瘤细胞的免疫逃逸和靶向治疗研究提供了一种全新的理念及实验依据，具有重要的理论价值及广阔的临床应用前景。

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