关于改良心肌保存液热缺血冷保存对猪心保护的作用

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【摘要】 　　目的 研究改良心肌保存液在心脏移植术中对热缺血冷保存猪供心的心肌保存效果。方法 16对供猪随机分为2组，建立猪同种异体原位心脏移植模型。A组以St Thomas 液、B组以自制液作为停搏液、灌注冲洗液和保存液。供心心脏停搏热缺血5 min后，以停搏液灌注，切取心脏，4 ℃灌注冲洗并低温浸泡保存4 h，施行同种异体原位心脏移植。观察移植后心脏复搏的一般情况及血清肌酸激酶同工酶（CKMB）变化，常规苏木精伊红、PAS染色，光镜观察心肌组织。结果 浸泡保存后B组心肌含水量低于A组，复灌后CKMB含量也低于A组(t=2.89～3.38，P&<0.05)。B组PAS糖原染色评分高于A组（T=24，P&<0.01）。结论 改良的新型心肌保存液能较好恢复热缺血冷保存的猪供心心脏功能，减轻复灌后的心肌再灌注损伤，减少保存期间细胞内糖原的消耗，其对心肌的保护明显优于St Thomas液。
【关键词】 器官保存液 心脏移植 热缺血 心肌保护
　　［ABSTRACT］ Objective To study the protective effect of modified heart preservation solution on a pig heart with warm ischemia. Methods Sixteen pairs of pig were evenly pided into two groups in random. An allogeneil graft model of orthotopic heart in pig was established. In group A， St Thomas solution was used as cardioplegic solution， perfusion fluid， and preservative fluid; in group B， selfmade solution was used. Donors’ hearts were subjected to warm ischemia for five minutes， then perfused with cold St Thomas solution or the cold modified solution， respectively， the hearts were removed and preserved in the aforementioned solutions at 4 ℃ for four hours， and the transplantation done. Serum creatine kinaseMB (CK MB)， MDA and SOD in myocardium were detected. Results After storage in the solutions， no significant differences were noted between the two groups interms of MDA and SOD; after reperfusion， the level of CKMB and MDA in myocardium was higher in group A， and SOD in myocardium was higher in group B. Conclusion Compared with St Thomas solution， the modified one offers better protection against warm ischemia of pig heart in terms of recovery of the heart function and decrease of reperfusion injury.
　　
　　［KEY WORDS］ Organic preservation solution; Heart transplantation; Myocardial preservation; Warm ischemia
　　
　　心脏移植已经成为难以救治心脏疾病的重要治疗选择。随着心脏移植的发展，供心的供需矛盾日益突出。许多学者目前正探讨将热缺血一定时间的“尸心”用于移植的可能性。世界上正在对供心的保存，尤其是对供心保存液的配方不断进行研究和改进，以求更有效地长时间保存供心，提高心脏移植手术的成功率。我院心外科在深入研究分析目前国内外各种常用的心脏保存液的基础上，研制出新型的改良心脏保存液。本文旨在通过模拟临床的动物实验，验证该新型心脏保存液对热缺血冷浸泡保存供心的保存效果。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验动物 同种同窝生的乳猪32只，普通饲养3～4周，体质量在60 kg左右。同性别配对，体质量差别不超过5％，分为供心者和受心者，体质量大的为供心者。
　　1.1.2 主要试剂与仪器 阿端为匈牙利吉瑞大药厂产品，咪达唑仑注射液为徐州恩华药业集团有限公司产品。St Thomas液、自制改良心脏保存液、手术中用的生理盐水等均由青岛市市立医院制剂室配制，St Thomas液、自制改良心脏保存液的配方见表1。Avanti 30台式高效冷冻离心机为美国贝克曼公司产品；低温冰箱为日本SONY公司产品；CWM301麻醉机为深圳晨伟医疗器械公司产品；SARNS7000体外循环机为美国SARNS公司产品；鼓泡氧合器、动脉微栓滤器和循环用动静脉插管为西安西京医疗器械公司产品；VIRIDIA 24型多功能监护仪为惠普公司产品。
　　1.2 研究方法
　　表1 心脏保护液配方对比表（略）
　　1.2.1 分组 将32只猪（16对）随机分为2组，A组术中以St Thomas液、B组以自制改良心脏保存液作为停搏液、灌注冲洗液和保存液。
　　1.2.2 供心切取 乳猪术前禁饮食12 h，手术前0.5 h肌肉注射氯胺酮10 mg/kg、阿托品0.02 mg/kg行基础麻醉。固定备皮，开放静脉通路，右颈内动脉、颈内静脉切开置管测压。麻醉诱导后行气管内插管，静脉注射肌松药，行机械通气，监测心电图、动静脉压、血氧饱和度等循环参数。正中切皮锯开胸骨，全身肝素化后打开心包，暴露心脏。游离上腔静脉，控制性快速放血约1 000 mL后结扎切断。放血同时阻断升主动脉，阻断5 min后（热缺血），在升主动脉的根部灌注4 ℃ St Thomas液或自制改良心脏保存液10 mL/kg；迅速剪断下腔静脉、右肺上动脉等，完整取出心脏，适当修剪的同时再用冷保存液10 mL/kg灌注冲洗心脏，然后放入盛有4 ℃相应的冷保存液的双层无菌塑料袋中，密闭封好；无菌塑料袋放入盛有冰水的保温桶中。
　　1.2.3 受心切取 受体猪麻醉，肝素化同供体。常规在升主动脉及上、下腔静脉插管建立体外循环。阻断升主动脉，受者心脏热缺血5 min后，在升主动脉根部灌注保护液，心脏切取、修剪冲洗和低温浸泡保存同供体。
　　1.2.4 心脏原位移植 保存4 h的供心与已经切除心脏、实行体外循环的受体行同种异体原位心脏移植。吻合完成后，开放升主动脉，供心再灌注， 使移植后的心脏复搏，逐步脱离体外循环，并维持正常循环3 h。
　　1.2.5 观察指标 ①供心复搏的一般情况。②血清肌酸激酶同工酶（CKMB）变化：供体术前及受体移植后主动脉开放1 min、1 h、2 h、3 h分别取动脉血，检测CKMB的变化。③心肌组织PAS糖原染色评分。
　　2 结果
　　2.1 供心复搏的一般情况
　　
　　A组心脏移植复灌后均需电除颤复搏，其中有1例一直不能复搏，另有2例受者因为严重的心律失常、心排血量低未能脱离体外循环。B组心脏移植复灌后有1例自动复搏，其余经过电除颤均复搏，其中有1例因为广泛渗血导致低血压未能脱离体外循环，另有1例发生Ⅱ度房室传导阻滞。
　　2.2 血清CKMB变化
　　
　　复灌后CKMB含量B组低于A组，差异有统计学意义(t=2.89～3.38，P&<0.05)。见表2。
　　2.3 PAS染色评分
　　
　　保存前两组细胞内糖原含量差异无统计学意义（P&>0.05）;保存4 h后，A组的细胞内糖原含量比B组减少，差异有统计学意义（T=24，P&<0.01）。见表3。
　　2.4 苏木精伊红染色检查
　　
　　两组保存前光镜下见心肌细胞轻度浊肿，有少量炎细胞浸润。保存4 h后，A组心肌细胞水肿，组织间隙增大，心肌纤维模糊，有炎细胞浸润；B组心肌水肿相对较轻。复灌3 h后，A组心肌内有灶状出血，心内膜下有出血，心肌细胞重度浊肿；B组毛细血管扩张充血，散在心肌间质灶状出血，有中性粒细胞浸润。
　　表2 两组血清CKMB变化（略）
　　表3 两组PAS 评分比较（略）
　　3 讨论
　　3.1 心脏移植的概况
　　供心热缺血期间，心肌代谢障碍，同时伴有不可逆的损伤，以至于供心再灌注后收缩功能不能恢复。供心的收缩功能能否恢复与供心热缺血时间长短、供心的保存方式、保存液的成分、保存方法和保存温度等有密切关系。如何延长供者心脏耐受缺血的时限，增加供心的来源是目前研究的热点。
　　
　　一种成功的心脏保存液，应该满足下列六项要求：保持细胞内环境的稳定；减少由于低温保存导致的细胞水肿；防止细胞酸化；防止细胞灌洗保存过程中细胞间隙膨胀；防止氧自由基的损伤，尤其是再灌注期；提供再生高能磷酸化合物的底物[1]。

　　3.2 改良心脏保存液的成分分析
　　
　　葡萄糖可为高能磷酸化合物的再生提供底物，减少心肌细胞的糖原消耗。谷胱甘肽是一种使过氧化氢失活的酶——谷胱甘肽过氧化物酶的辅助因子，可以减少对细胞有高度毒性的羟基的产生。谷胱甘肽也是一种氧自由基直接抑制剂，它可以减少细胞毒性因子，包括过氧化氢、过氧化脂、二硫化物、抗坏血酸以及自由基（包括羟基——一种在缺血再灌注期间形成的最具损伤力的自由基）的形成[2]。在缺血期间，心肌内源性谷胱甘肽减少。有研究分别用含有谷胱甘肽和不含谷胱甘肽的心肌保护液灌注并保存鼠心6 h，复灌1 h后，鼠心在经过有谷胱甘肽的心肌保护液保存后，左心室的收缩性及顺应性均有较好的恢复。谷胱甘肽有两种类型：还原型和氧化型，从理论上讲还原型是有效的，但在常温下存放3～4 d或者在4 ℃下存放3～4周还原型的谷胱甘肽可以转变为氧化型的谷胱甘肽。保存液中的谷胱甘肽由还原型转变为氧化型后，对器官的保存效果下降。冷冻保存的器官，组织低氧，细胞膜通透性增强，容易酸中毒。而组氨酸缓冲系统在5～35 ℃范围内能有效地抑制酸中毒[3]。 实验证明，含组氨酸的停搏液能有效保存心肌的ATP水平，减少氢离子的堆积，解除糖酵解的抑制，使ATP和乳酸有较大的生成率，促进了再灌注后心肌收缩功能的恢复，减少了再灌注导致的心肌坏死[4]。甘露醇作为氧自由基的清除剂，它可以防止氧自由基介导的内皮细胞的损伤，同时兼有渗透支持作用，在再灌注开始时能发挥一定的心肌保护作用。精氨酸是一氧化氮（NO）合成的前体，能够减轻心肌再灌注损伤，其作用机制等方面与NO的水平有关。心肌内皮细胞损伤于缺血再灌注后2.5～5.0 min即可出现，其主要特征是内皮细胞释放NO减少。若提供NO合成前体精氨酸，可使其在心肌局部维持一定的水平，减轻心肌再灌注损伤。
　　3.3 本实验的临床意义
　　
　　本次实验的麻醉、手术方式和体外循环等完全模拟临床；此外，实验中选用猪，猪心在解剖结构、病理生理机制等方面与人类非常相似，所以研究猪供心的热缺血、心脏移植和移植后的缺血再灌注损伤的病理生理机制对人类同种异体心脏移植具有重要的指导意义。
　　
　　20世纪60年代末期，人们试图将缺血停搏一定时间的“尸心”用于心脏移植，但没有成功［5］。至今，许多移植中心仍然把缺血停搏的心脏作为供心的禁忌。但是由于供心的严重缺乏，在目前情况下，为了扩大供心的来源，不得不考虑使用已经短时间热缺血的甚至停搏的心脏。一般认为常温下心脏耐受热缺血的时间很短。考虑到我院行人尸体肾移植供肾平均热缺血时间为5 min，在这个时间内，经过训练的专业人员是可以完成供心的灌洗切取，使其得到有效的冷保护，因此我们设计本实验在常温下缺血5 min，冷保存4 h，短距离运送并完成心脏移植，这个时间是足够的。本实验中，用改良心脏保存液灌注、保存的猪心脏移植后均能很快恢复比较满意的心功能，说明热缺血5 min 的尸体心脏作为供心是可行的。
　　
　　在我国开展的心脏移植手术中，大多采用St Thomas液单纯低温保存供心，其安全保存时限远不能满足临床心脏移植的需要［6 ］，特别是已经有热缺血损伤的供心，移植后心功能恢复不够理想［7］。本实验观察了St Thomas液和改良心脏保存液对已经短时间热缺血的猪心单纯冷保存4 h的效果，结果表明改良心脏保存液较St Thomas液有更好的心肌保护效果。改良心脏保存液能减轻心脏低温浸泡保存期间的心肌水肿；其含有葡萄糖，可为高能磷酸化合物的再生提供底物，减少细胞内糖原的消耗；可减轻心肌再灌注损伤；可使移植后的心脏更快恢复收缩功能。
　　
　　本研究结果提示，热缺血5 min的尸心可以作为心脏移植的供心使用，遗憾的是我们未设计观察最长安全热缺血时限，有待于今后进一步研究。

参考文献

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