关于丹红注射液对大鼠皮质神经元体外模拟缺血再灌注损伤的保护作用

　　　　　　作者：张红 张睿 张小乔 徐江华 李琴 梅元武

【摘要】 　　目的 探讨体外模拟缺血再灌注后大鼠皮质神经元内质网应激诱导凋亡的机制及丹红注射液对其的干预作用。方法 体外培养大鼠皮质神经元，神经元特异性烯醇酶（NSE）鉴定神经元纯度。建立体外培养大鼠皮质神经元模拟缺血再灌注模型，随机分为对照组（始终正常培养）、缺血再灌注组（体外模拟缺血再灌注）、治疗组（缺血再灌注加丹红注射液干预），应用免疫组织化学、免疫荧光染色方法鉴定神经元纯度；流式细胞术Annexin V、PI双标检测神经元凋亡率及活性半胱天冬酶(Caspase)3、Caspase8、Caspase9蛋白表达；Westernblot免疫印迹分析法检测活性Caspase12、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、Bcl2及细胞色素C蛋白表达。结果 大鼠皮质神经元可纯化体外培养。皮质神经元体外模拟缺血6 h再灌注24、 48 h细胞凋亡率分别为（17.95±1.03）％、（22.62±0.98）％，丹红治疗组（8 mL/L)分别为（9.74±0.56）％、 （3.93±0.23）％，两组比较差异有统计学意义（χ2=7.164、10.650，P&<0.05）。体外模拟缺血再灌注诱导神经元GRP78表达上调，活性Caspase12表达增加，但与治疗组比较差异无显著性（t=0.591、1.772，P&>0.05）。神经元缺血再灌注后细胞色素C表达增加，Bcl2表达减少，活性Caspase3、Caspase8、Caspase9表达增加，丹红注射液治疗后细胞Bcl2表达增加，细胞色素C释放减少，活性Caspase3、 Caspase8、Caspase9含量降低，两组比较差异有显著性（t=8.374～25.235，P&<0.05、0.01）。结论内质网应激参与神经元体外模拟缺血再灌注后细胞凋亡，丹红注射液能抑制模拟缺血再灌注后细胞凋亡。
【关键词】 神经元 再灌注损伤 内质网 应激 半胱天冬酶 丹红注射液 大鼠 Sprague Dawley
　　［ABSTRACT］ Objective To study the protection effect of danhong injection on rat cortical neurons during apoptotic induction of simulated ischemia/reperfusion in vitro. Methods Rat cortical neurons were cultured in vitro and identified by NSEimmunohistological staining and immunofluorescence staining. Neuronal ischemia/reperfusion models in vitro were established as followings: cultures were rinsed twice with PBS， then subjected to ischemia for 6 h in Earle’s without glucose by placing culture wells into an anaerobic chamber with an atmosphere of 0.05 CO2， 0.95 N2 at 37 ℃， reperfusion was performed by removing neuronal culture wells from the anaerobic chamber and adding normal medium to an incubator with an atmosphere of 0.05 CO2、 0.95 air at 37 ℃. Percentage of apoptotic cells and expression levels of active Caspase3，9，8 were determined by flow cytometric analysis. Protein levels of GRP78， Bcl2， Cyt C and active Caspase12 were assessed by immunoblotting. Results The apoptosis rate induced after reperfusion 24 h and 48 h was (17.95±1.03)% and (22.62±0.98)% respectively and was decreased to (9.74±0.56)% and (3.93±0.23)% after treated by danhong injection (8 mL/L) respectively (χ2=7.164，10.650;P&<0.05). Protein levels of GRP78 and Caspase12 in cortical neurons in response to ischemia 6 h and reperfusion 24 h or 48 h were elevated. Activated Caspase3，9，8 was detected at 24 h and 48 h after reperfusion and was reduced by danhong injection，and danhong injection increased the expression of bcl2 caused by ischemia/reperfusion but the released of cytochromec was inverse (t=8.374-25.235;P&<0.05，0.01). Conclusion ER stress is involved in neuronal apoptosis induced by analogous ischemia/reperfusion in vitro. Danhong injection can inhibit apoptosis caused by analogous ischemia/reperfusion (IS/RE) in vitro in rat cortical neurons.
　　
　　［KEY WORDS］ Neurons; Reperfusion Injury; Endoplasmic reticulum; Stress; Caspases; Salvia miltiorrhiza injection; Rats， SpragueDawley
　　
　　凋亡是脑缺血后神经元死亡的一种重要形式。线粒体功能受损，细胞色素C自线粒体腔释放到胞浆是脑缺血后神经元凋亡关键的一步[1]。内质网是细胞表面蛋白及分泌蛋白合成、折叠、修饰和运输的场所。内质网应激引起的生理功能失调可发生在多种疾病中，如阿尔茨海默病、帕金森病、神经元缺血损伤、朊病毒病、囊性纤维病、糖尿病等[2]。近年来研究认为，内质网应激持续存在可迅速导致细胞凋亡[3]。Caspase12为半胱天冬酶家族成员之一，位于内质网，可特异性被内质网应激激活[4]。各凋亡信号转导途径及各细胞器之间存在着复杂的相互联系。脑缺血再灌注后神经元凋亡的发生机制目前还不十分清楚。本实验旨在探讨大鼠皮质神经元原代培养体外模拟缺血再灌注后细胞凋亡发生的机制，了解线粒体功能及内质网应激之间的相互关系，以及丹红注射液对其的干预作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　
　　新生SD大鼠(出生24 h内)由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；高糖DMEM、Neuronbasal培养液、B27、胎牛血清、马血清等均购自GibcoBRL公司；胰蛋白酶、L多聚赖氨酸购自Sigma公司；Annexin VFITC 购自Bender Med Systems公司；AntiCaspase12、AntiGRP78多克隆抗体分别购自Stressgen公司；Active Caspase3、Caspase9、 Caspase8试剂盒购自BioVision公司；Bcl2、细胞色素C试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology公司；NSE组化检测试剂盒购自北京中山公司；其他试剂均为市售分析纯。CO2恒温细胞培养箱(Napco 5410220， USA)；荧光倒置显微镜（Olympus， JAPAN)；全自动酶标分析仪 (Thermo Electron Corporation Multiskan MK3， USA)；流式细胞仪（FACSCLSR，BectonDickton，USA)；激光扫描共聚焦显微镜(Olympus Fluoview FV 500 Imaging System，日本Olympus公司)。
　　1.2 方法
　　1.2.1 皮质神经元培养与鉴定 取出生24 h以内SD大鼠皮质于冷解剖液（4 ℃）中，剥离脑膜、血管，将脑组织剪成小于1 mm×1 mm×1 mm 的组织块，37 ℃水浴消化20 min， 加种植培养液(DMEM 中添加体积分数0.10胎牛血清及体积分数0.10马血清，pH 7.2～7.4) 终止消化并吹打，细胞悬液经200目滤网过滤，获得单细胞悬液，将1×106个细胞接种于预先包被多聚赖氨酸的35 cm培养皿。第2天更换维持培养液（Neuronbasal加体积分数0.02 B27），培养3～5 d半量换液，7～10 d用于实验。NSE免疫组织化学染色和IgG 免疫荧光染色(FITC 标记的兔抗鼠IgG 1∶200稀释) 鉴定神经元。
　　1.2.2 丹红注射液对原代神经元活力的影响 采用MTT法检测。取前述原代神经元（细胞密度1×106/L），按每孔100 μL接种于96孔板，培养5 d后随机分为空白对照组、阴性对照组、实验组，每组5个平行孔。实验组神经元加丹红注射液，终浓度分别为0.8、8.0、80.0 mL/L，分别继续培养1、2、3 d，每孔加入MTT 15 μL，37 ℃孵育4 h，镜下观察形成紫色针状结晶，小心弃去上清，每孔加入DMSO100 μL，室温下放置10 min，待镜下观察紫色结晶全部溶解后，以Dynatech MR 400 ELISA 读数仪测定波长570 nm处吸光度（A）值。
　　1.2.3 神经细胞体外模拟缺血再灌注模型的建立参照GOLDBERG等[5]的方法，取培养7～10 d 的神经元细胞，吸去原培养液，使用无糖Earle’s液洗2次后，加入无糖Earle’s液， 然后将细胞培养瓶或培养板置于可通气低氧罐内，向罐内持续缓慢通入含有体积分数0.95的N2和0.05的CO2混合气体以排除含氧的空气。通气30 min后，罐内含氧量低于0.01，夹闭低氧罐的进口与出口，置培养箱内密闭6 h（体外模拟缺血）。然后取出低氧罐，吸去无糖Earle’s液，换回维持培养液，放入恒温培养箱中继续培养24 h或48 h（再灌注）。
　　1.2.4 神经元凋亡检测 取上述分组培养的神经元胰蛋白酶消化后在4 ℃离心5 min， 去上清后细胞沉淀用冷PBS液洗2次， 加195 μL 结合缓冲液悬浮细胞， 然后加入Annexin VFITC 5 μL， 室温避光孵育10 min， 结合缓冲液洗3次，用190 μL结合缓冲液重悬细胞，加10 μL(20 mg/L)PI(终浓度1 mg/L)。流式细胞分析仪检测，重复3次。
　　1.2.5 活性Caspase3、Caspase9、Caspase8蛋白表达检测 前述各组及阴性对照组（正常培养的细胞培养液中加1 mL/L各种Caspase抑制剂共孵育）细胞（1×109/L）经消化、重悬，取300 μL细胞悬液于EP管中，每管分别加1 μL应用FITC标记的Caspase3、 Caspase9、 Caspase8，37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中孵育1 h。以3 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入0.5 mL缓冲液重悬细胞，再以3 000 r/min离心5 min，弃上清，300 μL缓冲液重悬细胞，流式细胞分析仪检测，重复3次。
　　1.2.6 Caspase12、GRP78、细胞色素C和Bcl2表达检测 采用Westernblot免疫印迹分析法。各组细胞按照总蛋白提取试剂盒方法操作提取总蛋白，按蛋白定量试剂盒说明定量。免疫印迹操作参照ELYAMAN等[6]的方法进行。每组实验至少重复3次。利用激光扫描光密度分析法半定量测定细胞活性ActiveCaspase12、GRP78、细胞色素C以及Bcl2水平变化。
　　1.3 统计学处理
　　
　　计量资料以±s表示。两组数据间比较采用t检验，多组数据间比较采用双因素方差分析，应用SPSS 12.0统计学软件进行数据计算。
　　2 结果
　　2.1 原代神经元培养
　　
　　培养7 d的皮质神经元经NSE染色后， NSE阳性细胞占细胞总数的（92.69±4.10）%(n=5)。故可认为是纯神经元培养。
　　2.2 不同浓度丹红注射液对原代神经元活力影响
　　
　　丹红注射液8.0 mL/L组第1～3天神经元的吸光度值高于对照组，80.0 mL/L组第2～3天神经元的吸光度值低于对照组，差异有显著性（F=35.551，q=3.081～5.326，P&<0.05)。各组作用不同时间之间比较，80 mL/L作用第2、3天吸光度明显低于第1天(F=29.246，q=3.641～4.070，P&<0.05)，其余两组不同时间之间比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。见表1。
　　表1 不同浓度丹红注射液对神经元活力的影响（略）
　　与对照组比较，F=35.551，*q=3.081～5.326，P&<0.05;组内不同时间比较，F=29.246，#q=3.641～4.070，P&<0.05
　　2.3 体外模拟缺血再灌注诱导的神经元凋亡
　　
　　用Annexin VFITC和PI联合染色，可以区分正常细胞(两种染色均阴性)、早期凋亡细胞(Annexin VFITC阳性，PI阴性)、晚期凋亡或死亡细胞(两种染色均阳性)。通过流式细胞仪测定，正常培养大鼠皮质神经元经体外模拟缺血再灌注后，细胞凋亡明显增加，24 h凋亡率为（17.95±1.03）％，至48 h凋亡率为（22.62±0.98）％；治疗组在缺血的的同时加用8 mL/L丹红注射液，再灌注至24 h凋亡率为（9.74±0.56）％，48 h凋亡率为（3.93±0.23）％，两组比较，差异均有显著意义（χ2=7.164、10.650，P&<0.05)。
　　2.4 活性Caspase3、 Caspase9、 Caspase8表达
　　
　　原代培养的神经元经体外模拟缺血6 h后再灌注24、48 h，活性Caspase3、 Caspase9、 Caspase8的表达明显，加用8 mL/L丹红注射液，三者表达均显著下降(t=8.374～22.107，P&<0.05)。见表2。
　　2.5 Caspase12、 GRP78、细胞色素C、Bcl2免疫印迹分析
　　
　　免疫印迹分析显示，神经元缺血再灌注24、48 h后，神经元GRP78免疫活性明显增加，丹红治疗组GRP78活性减低，两组相比差异无显著性（t=0.976、1.750，P&>0.05）。在缺血再灌注损伤24 h后，活性Caspase12表达增加，48 h时Caspase12表达下降；丹红治疗组活性Caspase12表达与对照组相似，两组比较差异无显著性（t=0.591、1.772，P&>0.05）。缺血再灌注损伤神经元细胞色素C表达增加，而丹红治疗组表达减低；神经元Bcl2免疫活性在缺血再灌注后有较低表达，丹红治疗组Bcl2表达明显增强，治疗前后相比，差异有统计学意义（t=13.536～25.235，P&<0.05）。见表3、4。

　　3 讨论
　　
　　多种细胞信号途径、应激状态可以引起细胞凋亡。近年来，内质网作为线粒体凋亡途径的调节器越来越受到重视[7]。作为内质网应激标志物的分子伴侣GRP78在内质网发生应激时表达上调[8]。内质网对氧化应激十分敏感[9]。人们还发现，内质网和线粒体位置很密切，可以通过分子弥散影响彼此的功能。内质网损伤和线粒体细胞色素C的释放可能存在关联性。本文结果显示，体外培养的大鼠皮质神经元在缺血6 h再灌注24、48 h后，GRP78免疫活性明显增加，提示神经元发生了内质网应激，各实验组神经元凋亡发生率均显著高于对照组。为了探讨培养神经元凋亡发生的机制，本文分别应用FCM、Western blot检测活性Caspase3、Caspase9、Caspase8、Caspase12的表达，实验结果显示，实验组Caspase12活性在再灌注24 h明显增强，而到了48 h则有所降低。提示Caspase12在内质网应激凋亡早期起到很大作用。神经元缺血再灌注后活性Caspase3、Caspase9以及Caspase8均明显增加，说明Caspase3、Caspase8、Caspase9、Caspase12均参与了缺血再灌注后的神经元凋亡。细胞凋亡是复杂的过程，线粒体途径、死亡受体途径、内质网应激等细胞器途径之间存在着复杂的相互联系。
　　表2 丹红注射液治疗前后各种Caspase表达比较（略）
　　与缺血再灌注组比较，*t=8.374～22.107，P&<0.05
　　表3 丹红注射液治疗24 h免疫印迹分析结果（略）
　　与缺血再灌注组比较，*t=13.536、18.936，P&<0.05
　　
　　表4 丹红注射液治疗48 h免疫印迹分析结果（略）
　　与缺血再灌注组比较，*t=13.76、25.235，P&<0.05
　　Bcl2蛋白家族，包括 Bcl2、 Bclx、Bad等，对凋亡起着重要的调节作用[10]。促凋亡因子Bax 和Bak通过促进线粒体释放细胞色素C而促进凋亡，Bcl2作用正相反。最近有证据表明，Bax 、 Bak和Bcl2也定位于内质网，并被内质网应激激活[11]。本实验显示，在内质网应激时，Bcl2免疫活性降低，细胞色素C表达增加。可能在细胞遭受应激反应时，内质网应激激活的相关Caspase是凋亡的早期事件，随后导致线粒体外膜通透性增加，细胞色素C释放到胞浆，进而促进凋亡复合体的形成，激活效应Caspase，引起凋亡。但体外培养大鼠皮质神经元凋亡中各途径之间的联系还有待进一步研究。
　　
　　丹红注射液由中药红花和丹参科学提取精制而成，主要成分为红花黄色素、丹参酮和丹参酚等。丹参可扩张脑动脉，降低血管阻力，降低血液黏度，增强红细胞变形能力，并能清除氧自由基，拮抗Ca2+内流，改善ATP酶活性， 同时也可提高脑组织耐低氧能力， 对脑组织具有明显的保护作用。红花具有活血通络、祛瘀止痛的作用，红花提取物在体内、体外均能明显抑制血小板聚集，对内源性凝血系统的激活有一定的抑制作用，有增加脑动脉血流量及营养脑细胞的作用[12]。给予体外培养的大鼠皮质神经元8 mL/L丹红注射液作用24、48 h后，细胞活力明显高于对照组，而80 mL/L浓度组细胞活力显著低于对照组。说明适当浓度丹红注射液对神经元存活有促进作用。丹红注射液是中药制剂，高浓度时可能存在细胞毒性，反而抑制细胞活性，具体机制尚需进一步研究。本文结果显示，丹红注射液作用于缺血再灌注损伤神经元24、48 h，细胞凋亡率明显减少，同时Bcl2免疫活性增强，细胞色素C表达减少，活性Caspase3、Caspase8、Caspase9表达均显著下降。但免疫印迹分析显示，GRP78及活性Caspase12的表达与对照组比较无显著差异。因此，我们认为丹红注射液对体外培养大鼠皮质神经元凋亡有抑制作用，其作用可能是通过上调Bcl2、抑制细胞色素C表达而实现的。
【参考文献】
　　[1]张红，谈金强，高吉亮，等. 肌苷对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和HSP70基因表达的影响[J]. 青岛大学医学院学报， 2004，40(4):300302.

　　[2]KAUFAM R J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease[J]. J Clin Invest， 2002，110(10):13891398.

　　[3]LEE A S. The glucoseregulated proteins: stress induction and clinical applications[J]. Trends Biochem Sci， 2001，26(8):504510.

　　[4]KAUFMAN R J. Stress signaling from the lumen of the endoplasmic reticulum:coordination of gene transcriptional and translational controls[J]. Genes Dev， 1999，13(10):12211233.

　　[5]NAKAGAWA T， ZHU H， MORISHIMA N， et al. Caspase12 mediates endoplasmic reticulumspecific apoptosis and cytotoxicity by amyloidbeta[J]. Nature， 2000，403(6765):98103.

　　[6]GOLDBERG W J， CONNOR J R， BERNSTRIN J J. Glial fibrillary acidic protein immunohistochemistry of spinal cord astrocytes after induction of ischemia or anoxia in culture[J]. J Neurosci Res， 1987，17(2):168175.

　　[7]ELYAMAN W， YARDIN C， HUGON J. Involvement of glycogen synthase kinase3b tau phosphorylation in neuronal Golgi disassemby[J]. J Neurochem， 2002，81(4):870880.

　　[8]SCORRANO L， OAKES S A， OPEFERMAN J， et al. BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum Ca2+:a control point for apoptosis[J]. Science， 2003，300(5616):135139.

　　[9]GULOW K， BIENERT D， HAAS I G. Bip is feedback regulated by control of protein translation effciency[J]. J Cell Sci， 2002，115(Pt 11):24432452.

　　[10]OYADONARI S， ARAKI E， MORI M. Endoplasmic reticulum stressmediated apoptosis in pancreatic betacells[J]. Apoptosis， 2002，7(4):335345.

　　[11]YANG J， LIU X， BHALLA K， et al. Prevention of apoptosis by Bcl2:release of cytochrome C from mitochondria blocked[J]. Science， 1997，275(5303):11291132.

　　[12]ZONG W X， LI C， HARZIVASSILIOU G， et al. Bax and Bak can localize to the endoplasmic reticulum to initiate apoptosis[J]. J Cell Biol， 2003，162(1):5969.

　　[13]辛勤，李秀芳，司端运. 丹参红花注射液对实验性大鼠脑缺血的保护作用[J]. 中成药， 2004，26(3):222224.

转贴于