藻酸双酯钠预防术后肠粘连的实验分析

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【摘要】 　　目的 观察藻酸双酯钠预防术后肠粘连的作用。方法 选用雌性Wistar大鼠36只，刮伤其盲肠浆膜，创面滴无水乙醇，钳夹盲肠系膜动脉制造大鼠肠粘连的动物模型， 随机将动物分成3组，分别在关腹前于创面涂布藻酸双酯钠、透明质酸钠、生理盐水，术后14 d将大鼠处死， 肉眼观察肠粘连程度并对粘连组织的基质金属蛋白酶(MMP)2和金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)2水平进行检测。结果 与生理盐水组比较，藻酸双酯钠组和透明质酸钠组均能降低术后肠粘连的程度（H=21.98，P&<0.05）；藻酸双酯钠组和透明质酸钠组MMP2的表达显著高于生理盐水组(F=29.34，q=5.27、10.83，P&<0.01);藻酸双酯钠组和透明质酸钠组TIMP2的表达显著低于生理盐水组(F=83.22，q=10.51、18.17，P&< 0.01)。结论 藻酸双酯钠具有预防术后肠粘连的作用。
【关键词】 藻酸双酯钠 肠粘连 基质金属蛋白酶类 金属蛋白酶组织抑制物
　　［ABSTRACT］ Objective To assess the effect of polysaccharide sulphate (PSS) on prevention of postoperative intestinal adhesions. Methods This study consisted of 36 male Wistar rats. A rat model of intestinal adhesions was done as follows: serous membrane of the caecum was scuffed， its raw surface was dropped with absolute alcohol， the mesentric artery of the caecum was then clamped. The rats were pided into three groups. PSS， sodium hyaluronate or normal saline was applied to the scraped cecum before closing the abdomen. The rats were killed 14 days after the operation， the adhesions were graded macroscopically， the content of matrix metalloproteinase 2 (MMP2) and tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 2 (TIMP2) in adhesive tissues were determined. Results Compared with normal saline， both PSS and sodium hyaluronate evidently reduced the extent of postoperative intestinal adhesions (H=21.98，P&<0.05)， and the expression of TIMP2 was decreased (F=83.22;q=10.51，18.17;P&<0.01) while MMP2 was increased (F=29.34;q=5.27，10.83;P&<0.01). Conclusion Postoperative intestinal adhesions can be prevented by polysaccharide sulphate.
　　
　　［KEY WORDS］ Polysaccharide sulphate; Intestinal adhesions; Matrix metalloproteinases; Tissue inhibitors of matrix metalloproteinase
　　
　　外科盆腹腔术后肠粘连一直是临床工作中的一大难题，如顽固性腹痛、不育及粘连性肠梗阻等，后者如不及时处理将导致腹腔炎、水电解质紊乱甚至危及生命。藻酸双酯钠(PSS)主要用于治疗缺血性心脑血管疾病等，外科可用于治疗手术后粘连、血栓性脉管炎等[1]。基质金属蛋白酶(MMP)2是一类能够降解细胞外基质(ECM)的蛋白质，金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)2是MMP2的抑制剂，能够下调MMP2的活性。MMP2主要在组织重建、修复、细胞迁移、血管生成、炎症反应、伤口愈合、肿瘤侵袭和转移等过程中发挥重要作用。近年还发现，MMP2及TIMP2与肠粘连的发生有密切联系[2]。本研究旨在通过制备大鼠肠粘连动物模型，观察藻酸双酯钠对肠粘连组织中MMP2和TIMP2表达水平的影响，以期深入探讨藻酸双酯钠预防肠粘连的作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　
　　选择健康雌性Wistar大鼠共36只，体质量为50～300 g，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。藻酸双酯钠由中国海洋大学管华诗院士提供。
　　1.2 动物模型制备
　　
　　36只雌性Wistar大鼠随机分为藻酸双酯钠（A）组、透明质酸钠（B）组、生理盐水（C）组。大鼠禁食12 h后，均在30 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下行开腹手术，仰卧位固定，剪毛消毒，无菌操作，取下腹正中切口约3 cm，打开腹腔，在距回盲部5 cm处取10 cm长一段回肠，用干纱布反复轻擦拭小肠浆膜层使其受损（面积约0.4 cm×10.0 cm），至其表面有针尖样出血点。滴无水乙醇于创面上，无齿镊夹持盲肠系膜动脉2 min，使局部缺血[3]，然后分别在A、B、C组创面上涂布藻酸双酯钠、透明质酸钠及生理盐水各2 mL，分两层关腹。术后禁食12 h，各组在相同条件下饲养。
　　1.3 检测指标与方法
　　1.3.1 肠粘连程度比较 术后14 d处死动物，取腹部U形切口，进行大体粘连程度分极，分级标准参考NAIR等[4]所报道的5级分类法确定。
　　1.3.2 MMP2和TIMP2测定 术后14 d取粘连肠壁组织，石蜡包埋，采用免疫组化SP法进行测定。一抗及SP试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，MMP2试剂盒购自Santa Cruz公司， TIMP2试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。3 μm厚连续切片，一张行苏木精伊红染色，余者采用PV6001/6002二步法行免疫组化染色，染色步骤按说明进行。免疫组化结果用自动图像分析软件进行分析。每张切片保持光线强度不变，随机选择3个视野(400倍)输入计算机进行分析，以平均吸光度(A)值作为MMP2、TIMP2的表达强度。
　　1.4 数据处理
　　
　　数据采用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析。粘连程度分级比较采用秩和检验；MMP2和TIMP2表达的比较采用方差分析。
　　2 结果
　　2.1 肠粘连程度大体观察
　　
　　术后14 d，各组动物均存活，无切口感染，与生理盐水组比较，藻酸双酯钠组和透明质酸钠组均能降低术后肠粘连的程度（H=21.98，P&<0.05）；而藻酸双酯钠组与透明质酸钠组比较，无显著性差异（P&>0.05）。见表1。
　　表1 藻酸双酯钠对术后肠粘连的影响（略）
　　2.2 各组免疫组化染色检测
　　
　　粘连组织MMP2和TIMP2表达的着色部位均在细胞浆，呈细颗粒状。其中MMP2的表达生理盐水组较弱，藻酸双酯钠组较强，透明质酸钠组的表达介于两者之间；而TIMP2的表达在生理盐水组较强，藻酸双酯钠组较弱，透明质酸钠组的表达介于两者之间。

　　2.3 MMP2和TIMP2的表达
　　
　　粘连组织中MMP2含量均有不同程度增加，其中藻酸双酯钠组和透明质酸钠组显著高于生理盐水组(F=29.34，q=5.27、10.83，P&<0.01); 藻酸双酯钠组和透明质酸钠组TIMP2表达显著低于生理盐水组(F=83.22，q=10.51、18.17，P&<0.01)。见表2。
　　表2 各组粘连组织中MMP2和TIMP2表达（略）
　　3 讨论
　　
　　创伤的愈合过程包括炎症反应、细胞迁移、血管生成、增生和组织重建，而ECM的蛋白水解作用是其中的关键。已发现的几种内源性蛋白酶包括MMP2都具有广泛的蛋白水解活性，它们在成熟的正常组织中低水平表达；但对于那些在正常情况下反复发生重建的组织，例如月经期中的子宫内膜组织中，则有较高的表达水平[5]。研究发现，腹腔间皮细胞、成纤维细胞和各种腹腔脏器的浆膜组织中，存在MMP2和TIMP2的活性表达。对人和大鼠因子宫内膜异位症和腹膜炎施行手术治疗而诱发粘连时所形成的相应膜组织进行检测显示，也能检测到MMP2和TIMP2的活性[6，7]。上述结果提示，在外科手术、感染和炎症导致细胞或组织损伤时，MMP2和TIMP2可能会影响腹腔创伤愈合的结果和粘连的形成。MMP2是一类依赖锌离子催化激活的细胞外蛋白水解酶，能够降解ECM，主要在组织修复、伤口愈合等过程中发挥作用；TIMP2是MMP2活性的抑制剂，能够下调MMP2的活性。TIMP2在多种组织中表达，除了能够抑制MMP2的蛋白水解活性外，还可调控细胞迁移、血管生成和细胞生长等。肠粘连发生的过程被局部作用的多种因子高度调控，其中包括MMP2和TIMP2。本文结果显示，藻酸双酯钠通过调控MMP2和TIMP2的表达，具有预防术后肠粘连的作用。对腹腔术后肠粘连的形成机制已有较深入的认识，简言之就是腹膜损伤后引发一系列炎症反应，进而引起纤维蛋白的渗出、沉积，而腹膜由于缺血、感染、异物存留等原因，对纤维蛋白的溶解能力降低，从而导致肠管间粘连带形成。因此，预防术后肠粘连主要应从以下几个方面入手：①减少创伤及其炎症反应；②降低纤维蛋白的渗出，促进其吸收；③增强腹膜纤溶活力；④隔离浆膜面。藻酸双酯钠预防术后肠粘连主要是通过与抗凝血酶结合，减少纤维蛋白沉积，促进纤维蛋白溶解酶原激活剂的活性，增强纤溶作用。
　　
　　藻酸双酯钠液态制剂作为简便易行、价廉、覆盖广泛的粘连预防制剂，可达到减少盆肠粘连的目的，有可观的经济和社会效益。我们认为对腹腔手术病人，除术中仔细操作、防止缺血及异物存留外，术后应用藻酸双酯钠不失为一种有效的措施。

参考文献

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　　[3]HEMADEH O， CHILUKURI S， BONET V， et al. Prevention of peritoneal adhesions by administration of sodium corboxymethyl cellulose and oral vitamin E[J]. Surgery， 1993，114:907.

　　[4]NAIR S K， BHAL Z K， AURORA A L. Role of proteolytic enzymes in the prevention of postoperative intraperitoneal adhesions[J]. Arch Surg， 1974，108:849.

　　[5]SALAMONSEN L. Matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in el1．dometrial remodeling and menstruation[J]. Reprod Med， 1996，53(2)：l85.

　　[6]CHEGINI N， KOTSEOS K， ZHAO Y， et al. Expression of matrix metalloproteinases(MMP1) and tissue inhibitor of MMP serosal tissue of intraperitoneal organs and adhesions[J]. Fertil Steril， 2001，76(2)：1212.

　　[7]夏玉芳，娄艳辉，郭新华，等. MMP2、TIMP2及VEGF蛋白在子宫内膜异位症裸鼠模型组织中的表达和意义[J]. 青岛大学医学院学报， 2007，43(4)：313315.